中药干预细胞凋亡线粒体通路研究进展
核心提示： 细胞凋亡是细胞在特定条件下的一种程序性死亡模式，既在机体正常发育、保持自身稳定方面发挥重要作用，又在病理情况下引发细胞过度死亡，使组织器官丧失功能，因此，抗细胞凋亡已成为目前药物机制研究的热点。线粒体作为细
细胞凋亡是细胞在特定条件下的一种程序性死亡模式，既在机体正常发育、保持自身稳定方面发挥重要作用，又在病理情况下引发细胞过度死亡，使组织器官丧失功能，因此，抗细胞凋亡已成为目前药物机制研究的热点。线粒体作为细胞凋亡过程的关键环节，是抗凋亡药物研究的重要靶标。在中药抗线粒体损伤、抑制细胞凋亡方面的研究日益深入，并取得了重要进展。笔者现就近年来中药及中药有效成分通过干预线粒体相关通路抑制细胞凋亡的研究进行综述，以期为中药抗细胞凋亡的研究提供思路和依据。
1 细胞凋亡的线粒体相关通路
线粒体是重要的细胞器之一，为细胞活动提供能量，并参与多种生理、病理过程，其中包括细胞凋亡。线粒体膜间隙中含有多种控制凋亡的可溶性蛋白质，以促凋亡为主，包括细胞色素c(cyt c)、核酸内切酶G(endonuclease G)、凋亡诱导因子(AIF)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶的激活剂／等电点IAP直接结合蛋白(smac／DIABL0)、丝氨酸蛋白酶Omi／HtrA2等，这些蛋白质一旦进入胞质，将引起线粒体功能丧失，其中Cyt c的释放最为严重，可通过一系列级联反应激活细胞凋亡蛋白酶(Caspase)一3、Caspase一7，使线粒体功能迅速丧失，其他几种蛋白则效应缓慢(Caspase基因剔除依然有效)，最终均将导致细胞凋亡。线粒体诱导的细胞凋亡，主要通过Cyt c释放介导的Caspase依赖通路，但又与后几种间隙蛋白释放所介导的Caspase非依赖通路密切相关。
膜间隙促凋亡蛋白质通过2种方式释放：①线粒体外膜的通透化(MOMP)，Bak／Bax寡聚化插入线粒体外膜，形成穿膜孔道将间隙蛋白释放(此过程受Bcl-2蛋白抑制)，p53蛋白诱导细胞凋亡的部分路径依赖此方式释放促凋亡蛋白；②线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，使小分子物质涌入，引起线粒体膨胀，撑破外膜而释放间隙蛋白。
上述细胞凋亡的线粒体通路，是中药抗凋亡作用的重要内容。围绕这些内容，已经对中药成分、中药提取物及中药复方进行了相关研究，初步阐述了中药在抗线粒体损伤、调节线粒体促凋亡蛋白释放、抑制Caspase活化等方面的作用，为深入研究中药抗细胞凋亡奠定了基础。
2 中药有效成分对线粒体凋亡通路的影响
研究显示，羟基红花黄色素A(HSYA)能上调缺氧损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Bcl-2／Bax蛋白比例Ⅲ和氧糖剥夺一恢复损伤的嗜铬细胞瘤细胞(PCI2)的Bcl-2／Bax蛋白比例，并抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性；激活离体灌流心脏的内皮依赖性一氧化氮合酶(eNOS)，增加一氧化氮(N0)的产生，抑制缺血再灌注诱导的MPTP开放。
葛根素(puerarin)能调节醋酸铅损伤的大鼠肾脏Bcl一2／Bax蛋白平衡，抑制Cyt c释放，并增强蛋白激酶B(Akt)磷酸化，促进eNOS磷酸化，增加N0合成；调节卜甲基一4一苯
基吡啶(MPP+)损伤的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)BcI-2／Bax蛋白平衡，降低Caspase-3活性；增加大脑中动脉阻塞一复灌注大鼠大脑的X连锁凋亡抑制蛋白(XlAP)含量，抑制Caspases活化，并可多途径调节细胞凋亡。
丹酚酸B(salvianolic acid B)能调节腹腔注射脂多糖和D一半乳糖损伤的小鼠肝脏以及放线菌素一D和肿瘤坏死因子-a【(TNF-a)损伤的HL-7702肝细胞的Bcl-2／Bax蛋白平衡，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性；抑制间歇性高糖诱导神经鞘细胞(schwann)的Cyt c释放及AIF核转移，降低Bax蛋白含量，抑制Caspase-9及Caspase-3活性；抑制氧糖剥夺一恢复诱导的原代培养胎鼠脑皮层神经细胞线粒体膜电位△￥(m)降低及Cyt c释放；增强结扎双侧颈总动脉小鼠大脑线粒体膜电位和Na+一KLATP酶活性。
白藜芦醇(resveratr01)能抑制白细胞介素(IL)-1B诱导离体培养的软骨细胞△￥(m)降低，及Cyt c释放，抑制冷藏一温灌注引起的离体人肝脏组织MPTP开放及Cyt c释放，增强呼吸链活性，增加ATP生成；抑制缺氧一复氧诱导的脑细胞分离线粒体△￥王，(m)降低和Cyt c释放，维持线粒体膜流动性。
益母草碱(1eonurine，SCMl98)能调节低氧+血清剥夺损伤的原代培养乳鼠心肌细胞和H9c2细胞株Bcl一2／Bax基因及蛋白平衡；抑制过氧化氢(H202)诱导的H9c2细胞Bax线粒体转位，稳定△￥(m)，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性。
红景天苷(rhodioside)能维持Fe2+-cysteine系统损伤的大鼠脑皮层离体线粒体HLATP酶活性和呼吸链复合物Ⅳ活性；调节永久结扎冠状动脉左前降支大鼠心脏Bcl一2／Bax基因及蛋白平衡，增加eNOS的mRNA表达；抑制卜甲基一4一苯基吡啶诱导原代培养乳鼠脑皮层神经细胞Cyt c释放；稳定氧糖剥夺原代培养乳鼠心肌细胞△r(m)稳定。
3 中药提取物对线粒体凋亡通路的影响
以中药有效部位为主要成分的中药提取物对线粒体凋亡通路的研究，是抗凋亡研究的一个新生力量，逐渐被研究人员关注和重视，如蒺藜、黄芪、三七等特定组分提取物，在线粒体凋亡通路几个关键病理环节方面的研究，已取得了可观成果。
研究表明，蒺藜皂苷(GSTT)及其主要成分刺蒺藜素(tribulosin)能调节缺血再灌注损伤离体大鼠心脏和过氧化氢(H202)损伤的原代培养乳鼠心肌细胞的Bcl-2／Bax蛋白平衡，降低Caspase-3活性；抑制氧糖剥夺一恢复诱导原代培养胎鼠脑皮层神经细胞△T(m)的下降及Caspase一3、Caspase-7活性。
黄芪多糖(ASP)能降低H202损伤大鼠成纤维细胞的Bax蛋白含量，抑制Caspase-9Caspase-3活化，稳定△￥(m)；增强高脂+链脲佐霉素+盲肠结扎穿孔损伤大鼠胰腺Na+-K~-ATP酶、Ca2*-Mg2+-ATP酶活性。
三七总皂苷(PNs)能增加H202损伤的大鼠肺血管内皮细胞Bcl一2蛋白含量，稳定△￥，(m)，降低Caspase-3活性；增强。肾动脉夹闭一松开大鼠肾脏Cyt c氧化酶活性。
银杏叶提取物(EGb)能稳定硝普钠(SNP)或H20：损伤PCI2细胞的△￥(m)，抑制ATP水下降，并降低Caspase一9活性[2el；调节阿霉素损伤原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2家族蛋白平衡，稳定△￥(m)，降低p53 mRNA含量；提高百草枯(Paraquat)损伤的PCI2细胞系Bcl一2蛋白含量，稳定△￥(m)，降低Caspase-3活性。
冬虫夏草取物能稳定H202损伤的RAW264．7细胞△￥(m)：调节高糖损伤人脐静脉内皮细胞Bcl-2／Bax蛋白平衡，稳定△￥(m)，降低Caspase-3活性。
4中药复方对线粒体凋亡通路的影响
现有的研究结果已表明中药复方具有明确的抗细胞凋亡作用，其中对线粒体通路相关环节的研究最为丰富，主要通过细胞和动物模型，围绕心脑血管及肾脏损伤疾病，在一定程度上阐明了中药复方多靶标的作用特点。
一些中药注射剂效果突出、研究较为深入，并在临床得到广泛应用。如参麦注射液能维持缺氧损伤原代培养乳鼠心肌细胞△T(m)，降低Caspase-3和Caspase-7活性；参附注射液能降低缺氧复氧损伤原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2蛋白含量及Caspase-3活性，降低缺血再灌注损伤的大鼠肠黏膜上皮细胞Caspase-3活性；丹红注射液能降低大脑中动脉阻塞一复灌大鼠大脑Caspase一3活性，增加氧糖剥夺一恢复原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2含量，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性，调节大鼠移植肾脏Bcl-2／Bax蛋白平衡。
其他一些效果显著的复方的研究也取得了显著进展。如复方丹参滴丸能稳定左冠状动脉降支结扎一复灌大鼠在体心脏Bcl一2／Bax蛋白平衡，降低Cyt c含量及Caspase-3活性；温补肾阳药能维持切除甲状腺或肾上腺大鼠肝脏△T(m)的稳定，增加ATP生成；健脾祛湿方能增强鼠源乙酰胆碱c【亚基97一116肽段损伤的大鼠骨骼肌细胞Cyt c氧化酶的活性，增加ATP生成；芪棱汤能稳定大脑中动脉阻塞一复灌大鼠大脑细胞线粒体膜电位，抑制Cyt c释放，降低Caspase-9活性：疏肝活血、健脾化痰方能增强软脂酸损伤的原代培养乳鼠肝细胞的Cyt c氧化酶、Na~-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；还少丹能增强D一半乳糖损伤小鼠心肌细胞线粒体复合物I和Ⅳ、Na+-K+一ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；耳聋左慈丸能调节庆大霉素损伤原代培养小鼠乳鼠耳蜗基底膜毛细胞的Bci-2／Bax蛋白平衡，抑制Caspase-3和Caspase-9活性[44J；血府逐瘀汤能抑制Ⅶ型胶原酶脑内立体定位注射损伤的大鼠大脑细胞Cyt c释放。
5展望
综上所述，目前的研究主要围绕两方面展开。①抑制线粒体凋亡通路的关键点：上调Bcl一2，下调Bax，抑制MOMP的发生：抑制MPTP的开放：保持线粒体膜结构完整，维持膜电位稳定；减少Cyt c等膜间隙促凋亡蛋白释放；抑制Caspase蛋白的逐级激活。②维持线粒体的正常机能：维持线粒体电子传递链的正常运行和ATP的供应；增强离子转运机制相关酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2*-ATP酶)的活性，维持胞质内正常离子浓度；提高线粒体自我修复能力。这些研究表明，中药及中药有效成分可通过多种途径作用于细胞凋亡线粒体通路，发挥抗线粒体损伤、抑制细胞凋亡的作用。
尽管上述研究取得了很大进展，但也存在一些明显的问题：①现有的研究多围绕某一指标展开，研究内容相对单薄、孤立，虽能表明药物对不同病理环节的作用，但不能有效整合出一条清晰的通路来说明其如何发挥作用；②未能围绕某作用途径展开系统的研究，没有深入阐明药物影响细胞凋亡线粒体通路的作用机制。笔者认为，今后研究应紧紧抓住药物作用的直接位点设计实验，以所选位点为中心，排除上游干扰证实药效后，再阻断下游通路验证作用位点的直接性，并逐步阐明药物在各个病理环节如何发挥作用，系统分析药物作用的机制，为临床用药提供科学依据。
1 细胞凋亡的线粒体相关通路
线粒体是重要的细胞器之一，为细胞活动提供能量，并参与多种生理、病理过程，其中包括细胞凋亡。线粒体膜间隙中含有多种控制凋亡的可溶性蛋白质，以促凋亡为主，包括细胞色素c(cyt c)、核酸内切酶G(endonuclease G)、凋亡诱导因子(AIF)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶的激活剂／等电点IAP直接结合蛋白(smac／DIABL0)、丝氨酸蛋白酶Omi／HtrA2等，这些蛋白质一旦进入胞质，将引起线粒体功能丧失，其中Cyt c的释放最为严重，可通过一系列级联反应激活细胞凋亡蛋白酶(Caspase)一3、Caspase一7，使线粒体功能迅速丧失，其他几种蛋白则效应缓慢(Caspase基因剔除依然有效)，最终均将导致细胞凋亡。线粒体诱导的细胞凋亡，主要通过Cyt c释放介导的Caspase依赖通路，但又与后几种间隙蛋白释放所介导的Caspase非依赖通路密切相关。
膜间隙促凋亡蛋白质通过2种方式释放：①线粒体外膜的通透化(MOMP)，Bak／Bax寡聚化插入线粒体外膜，形成穿膜孔道将间隙蛋白释放(此过程受Bcl-2蛋白抑制)，p53蛋白诱导细胞凋亡的部分路径依赖此方式释放促凋亡蛋白；②线粒体通透性转换孔(MPTP)开放，使小分子物质涌入，引起线粒体膨胀，撑破外膜而释放间隙蛋白。
上述细胞凋亡的线粒体通路，是中药抗凋亡作用的重要内容。围绕这些内容，已经对中药成分、中药提取物及中药复方进行了相关研究，初步阐述了中药在抗线粒体损伤、调节线粒体促凋亡蛋白释放、抑制Caspase活化等方面的作用，为深入研究中药抗细胞凋亡奠定了基础。
2 中药有效成分对线粒体凋亡通路的影响
研究显示，羟基红花黄色素A(HSYA)能上调缺氧损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Bcl-2／Bax蛋白比例Ⅲ和氧糖剥夺一恢复损伤的嗜铬细胞瘤细胞(PCI2)的Bcl-2／Bax蛋白比例，并抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性；激活离体灌流心脏的内皮依赖性一氧化氮合酶(eNOS)，增加一氧化氮(N0)的产生，抑制缺血再灌注诱导的MPTP开放。
葛根素(puerarin)能调节醋酸铅损伤的大鼠肾脏Bcl一2／Bax蛋白平衡，抑制Cyt c释放，并增强蛋白激酶B(Akt)磷酸化，促进eNOS磷酸化，增加N0合成；调节卜甲基一4一苯
基吡啶(MPP+)损伤的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)BcI-2／Bax蛋白平衡，降低Caspase-3活性；增加大脑中动脉阻塞一复灌注大鼠大脑的X连锁凋亡抑制蛋白(XlAP)含量，抑制Caspases活化，并可多途径调节细胞凋亡。
丹酚酸B(salvianolic acid B)能调节腹腔注射脂多糖和D一半乳糖损伤的小鼠肝脏以及放线菌素一D和肿瘤坏死因子-a【(TNF-a)损伤的HL-7702肝细胞的Bcl-2／Bax蛋白平衡，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性；抑制间歇性高糖诱导神经鞘细胞(schwann)的Cyt c释放及AIF核转移，降低Bax蛋白含量，抑制Caspase-9及Caspase-3活性；抑制氧糖剥夺一恢复诱导的原代培养胎鼠脑皮层神经细胞线粒体膜电位△￥(m)降低及Cyt c释放；增强结扎双侧颈总动脉小鼠大脑线粒体膜电位和Na+一KLATP酶活性。
白藜芦醇(resveratr01)能抑制白细胞介素(IL)-1B诱导离体培养的软骨细胞△￥(m)降低，及Cyt c释放，抑制冷藏一温灌注引起的离体人肝脏组织MPTP开放及Cyt c释放，增强呼吸链活性，增加ATP生成；抑制缺氧一复氧诱导的脑细胞分离线粒体△￥王，(m)降低和Cyt c释放，维持线粒体膜流动性。
益母草碱(1eonurine，SCMl98)能调节低氧+血清剥夺损伤的原代培养乳鼠心肌细胞和H9c2细胞株Bcl一2／Bax基因及蛋白平衡；抑制过氧化氢(H202)诱导的H9c2细胞Bax线粒体转位，稳定△￥(m)，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3活性。
红景天苷(rhodioside)能维持Fe2+-cysteine系统损伤的大鼠脑皮层离体线粒体HLATP酶活性和呼吸链复合物Ⅳ活性；调节永久结扎冠状动脉左前降支大鼠心脏Bcl一2／Bax基因及蛋白平衡，增加eNOS的mRNA表达；抑制卜甲基一4一苯基吡啶诱导原代培养乳鼠脑皮层神经细胞Cyt c释放；稳定氧糖剥夺原代培养乳鼠心肌细胞△r(m)稳定。
3 中药提取物对线粒体凋亡通路的影响
以中药有效部位为主要成分的中药提取物对线粒体凋亡通路的研究，是抗凋亡研究的一个新生力量，逐渐被研究人员关注和重视，如蒺藜、黄芪、三七等特定组分提取物，在线粒体凋亡通路几个关键病理环节方面的研究，已取得了可观成果。
研究表明，蒺藜皂苷(GSTT)及其主要成分刺蒺藜素(tribulosin)能调节缺血再灌注损伤离体大鼠心脏和过氧化氢(H202)损伤的原代培养乳鼠心肌细胞的Bcl-2／Bax蛋白平衡，降低Caspase-3活性；抑制氧糖剥夺一恢复诱导原代培养胎鼠脑皮层神经细胞△T(m)的下降及Caspase一3、Caspase-7活性。
黄芪多糖(ASP)能降低H202损伤大鼠成纤维细胞的Bax蛋白含量，抑制Caspase-9Caspase-3活化，稳定△￥(m)；增强高脂+链脲佐霉素+盲肠结扎穿孔损伤大鼠胰腺Na+-K~-ATP酶、Ca2*-Mg2+-ATP酶活性。
三七总皂苷(PNs)能增加H202损伤的大鼠肺血管内皮细胞Bcl一2蛋白含量，稳定△￥，(m)，降低Caspase-3活性；增强。肾动脉夹闭一松开大鼠肾脏Cyt c氧化酶活性。
银杏叶提取物(EGb)能稳定硝普钠(SNP)或H20：损伤PCI2细胞的△￥(m)，抑制ATP水下降，并降低Caspase一9活性[2el；调节阿霉素损伤原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2家族蛋白平衡，稳定△￥(m)，降低p53 mRNA含量；提高百草枯(Paraquat)损伤的PCI2细胞系Bcl一2蛋白含量，稳定△￥(m)，降低Caspase-3活性。
冬虫夏草取物能稳定H202损伤的RAW264．7细胞△￥(m)：调节高糖损伤人脐静脉内皮细胞Bcl-2／Bax蛋白平衡，稳定△￥(m)，降低Caspase-3活性。
4中药复方对线粒体凋亡通路的影响
现有的研究结果已表明中药复方具有明确的抗细胞凋亡作用，其中对线粒体通路相关环节的研究最为丰富，主要通过细胞和动物模型，围绕心脑血管及肾脏损伤疾病，在一定程度上阐明了中药复方多靶标的作用特点。
一些中药注射剂效果突出、研究较为深入，并在临床得到广泛应用。如参麦注射液能维持缺氧损伤原代培养乳鼠心肌细胞△T(m)，降低Caspase-3和Caspase-7活性；参附注射液能降低缺氧复氧损伤原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2蛋白含量及Caspase-3活性，降低缺血再灌注损伤的大鼠肠黏膜上皮细胞Caspase-3活性；丹红注射液能降低大脑中动脉阻塞一复灌大鼠大脑Caspase一3活性，增加氧糖剥夺一恢复原代培养乳鼠心肌细胞Bcl-2含量，抑制Cyt c释放，降低Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性，调节大鼠移植肾脏Bcl-2／Bax蛋白平衡。
其他一些效果显著的复方的研究也取得了显著进展。如复方丹参滴丸能稳定左冠状动脉降支结扎一复灌大鼠在体心脏Bcl一2／Bax蛋白平衡，降低Cyt c含量及Caspase-3活性；温补肾阳药能维持切除甲状腺或肾上腺大鼠肝脏△T(m)的稳定，增加ATP生成；健脾祛湿方能增强鼠源乙酰胆碱c【亚基97一116肽段损伤的大鼠骨骼肌细胞Cyt c氧化酶的活性，增加ATP生成；芪棱汤能稳定大脑中动脉阻塞一复灌大鼠大脑细胞线粒体膜电位，抑制Cyt c释放，降低Caspase-9活性：疏肝活血、健脾化痰方能增强软脂酸损伤的原代培养乳鼠肝细胞的Cyt c氧化酶、Na~-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；还少丹能增强D一半乳糖损伤小鼠心肌细胞线粒体复合物I和Ⅳ、Na+-K+一ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；耳聋左慈丸能调节庆大霉素损伤原代培养小鼠乳鼠耳蜗基底膜毛细胞的Bci-2／Bax蛋白平衡，抑制Caspase-3和Caspase-9活性[44J；血府逐瘀汤能抑制Ⅶ型胶原酶脑内立体定位注射损伤的大鼠大脑细胞Cyt c释放。
5展望
综上所述，目前的研究主要围绕两方面展开。①抑制线粒体凋亡通路的关键点：上调Bcl一2，下调Bax，抑制MOMP的发生：抑制MPTP的开放：保持线粒体膜结构完整，维持膜电位稳定；减少Cyt c等膜间隙促凋亡蛋白释放；抑制Caspase蛋白的逐级激活。②维持线粒体的正常机能：维持线粒体电子传递链的正常运行和ATP的供应；增强离子转运机制相关酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2*-ATP酶)的活性，维持胞质内正常离子浓度；提高线粒体自我修复能力。这些研究表明，中药及中药有效成分可通过多种途径作用于细胞凋亡线粒体通路，发挥抗线粒体损伤、抑制细胞凋亡的作用。
尽管上述研究取得了很大进展，但也存在一些明显的问题：①现有的研究多围绕某一指标展开，研究内容相对单薄、孤立，虽能表明药物对不同病理环节的作用，但不能有效整合出一条清晰的通路来说明其如何发挥作用；②未能围绕某作用途径展开系统的研究，没有深入阐明药物影响细胞凋亡线粒体通路的作用机制。笔者认为，今后研究应紧紧抓住药物作用的直接位点设计实验，以所选位点为中心，排除上游干扰证实药效后，再阻断下游通路验证作用位点的直接性，并逐步阐明药物在各个病理环节如何发挥作用，系统分析药物作用的机制，为临床用药提供科学依据。
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