生物芯片技术及其在中医药研究中的应用进展

    生物芯片(hi0—chip)是指将生物分子(寡聚核苷酸、DNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等)以阵列形式固定于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品靶分子进行杂交或相互作用后，通过特定的仪器对反应信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的种类与数量。由于生物活性物质微小，以点阵的方式排列在硅基上，很像计算机的芯片，所以它被称为“生物芯片”。其采用微电子学的并行处理和高密度集成技术，可同时并行分析成千上万种生物样品，具有高通量、微型化、自动化以及检测样品用量少等优点。生物芯片分为功能生物芯片和信息生物芯片。常见的功能生物芯片有微流体芯片和芯片实验室；信息生物芯片分为基因芯片、蛋白芯片、组织芯片、细胞芯片。文章简述了生物芯片技术，并综述了近年来基因芯片和蛋白芯片在中医药中的应用进展。

 生物芯片技术

 1-基因芯片基因芯片技术以其高通量、易操作和反应快速等特点已经成为近些年来的研究热点。随着分子生物学和基因组学的深入发展，大量的基因芯片已经被开发和应用。在基因组学研究中，基因芯片应用于很多方面：基因表达、单核苷酸多态性(slngle nucleotide polymorphism，SNP)、基因组拷贝数变异(c。PY number variation，CNV)、比较基因组(comparative genomic hybridization，CGH)、基因组甲基化、microRNA、启动子检测以及基因表达调节谱检测等。基因芯片分为。DNA芯片和寡核苷酸(Oligo)芯片两类。

    1·l   cDNA芯片 cDNA芯片可以检测待测样品中是否有与之互补的序列。提取待测样品中的mRNA，通过反转录获得的cDNA并荧光标记，与包含基因的cDNA微阵列进行杂交反应后，进行激光扫描，测定荧光强度，推算出待测样品中各种基因的表达水平。与传统检测RNA表达水平的技术相比较，。DNA芯片具备高通量的优势，因此越来越多的应用于基因表达检测等各方面。

    1．2 oligo芯片 Oligo芯片的原理与cDNA芯片类似，也是通过碱基互补配对进行杂交，检测对应序列片段。不同于。DNA,e,,片的是：0li90芯片固定的探针为特定的Oligo片段。cDNA芯片由于基因序列长短不同以致Tm值各异，众多的基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件很难统一，限制了它的分辨能力。Oligo芯片序列选择经过优化，利用合成的一定长度的0li9。单链探针代替全长cDNA点样，制成芯片。其优点是：无需扩增，防止扩增失败影响实验；减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；杂交温度均一，提高杂交效率；减少二级结构。这些特点使得0ligo芯片的应用日益广泛。但是，当0ligo序列较短时，单一的序列不足以代表整个基因，需要用多段序列。

    2．蛋白芯片蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，是直接在蛋白水平上检测表达模式。蛋白芯片在固相支持物表面高度密集排列的探针蛋白点阵或抗体阵列，当待测靶蛋白与其反应时，可特异性的捕获样品中的靶蛋白或其他分子，然后通过标记荧光、化学发光物质和放射性物质等进行检测分析；也可以采用SELDl蛋白芯片技术，即通过表面增强激光解析离子化—飞行时间质谱(SELDl—TOF—MS)将靶蛋白离子化，直接对其进行定性、定量分析。此外，还有微孔型芯片、毛细管电泳型芯片和液相载体型芯片等。蛋白芯片为我们提供了一种高通量的，比传统的凝胶电泳、western blot及ELISA更为方便和快速的研究蛋白质的技术。

    3．组织芯片组织芯片成为近十年来组织一基础研究的标准工具，主要应用于肿瘤研究。在组织芯片技术中，几十至上千不同肿瘤组织样本被排列在同一石蜡块上，用于各种原位分析。组织芯片可以同时从DNA，RNA或蛋白质水平上分析上千不同的肿瘤组织，在短时间内分析大量的分子。实验中既节省试剂，又能保证条件的一致性并减少不同批次间的误差。而且，多种不同组织芯片的组合可以快速并全面描述有意义的生物标志物。根据研究目的不同，组织芯片可以分为肿瘤或正常组织芯片、单一或复合型组织芯片、特定病理类型组织芯片以及肿瘤进展芯片和预后芯片等。组织芯片虽然已经广泛应用于研究和质量保证系统，但尚未应用于临床。

    4．细胞芯片 细胞芯片又称为细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生物芯片。它是适应后基因组时代人类对生命科学探索的要求而产生的。作为细胞研究领域的一种新技术，它既保持了传统细胞研究方法的优点如原位检测等，又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求。目前常见的细胞芯片有整合的微流体细胞芯片、微量电穿孔细胞芯片、细胞免疫芯片。细胞芯片广泛应用于细胞的固定培养、鉴定筛选、分化刺激、原位检测、药物开发筛选、组分分析及细胞免疫工程等各个方面。

    生物芯片技术在中医药中的应用

    生物芯片现在已经广泛的应用于功能基因组研究、突变检测、疾病分子诊断、药物机制研究以及药物筛选等诸多方面，在中医药研究中也发挥着越来越大的作用。中医学的核心是整体观和辨证施治，体现在中医临床重视患者的体质特征、证候特点，强调辨证施治，实施个性化治疗。疾病在特定证候下基因和蛋白整体水平的变化有可能反映了证候的本质，而在微观水平的基因和蛋白调控与修饰整体的变化，反映着生命机体的整体功能状态。中药、针灸等的微观调控对改善疾病状态下的整体失衡具有重要意义。这给我们运用生物芯片技术开展中医药研究提供了思路。

    1．中医证候证候，是对症状和体征进行分析、综合、归纳而得出的结论。由于疾病的复杂性，患者症状的主观性，如何客观地辨认证候是中医治疗的难点。随着生物芯片技术的日益成熟，运用大规模、高通量的生物芯片技术，对足够数量的证候的基因或蛋白表达(谱)进行定量分析，并建立相应的数据库，是研究证候客观化的基础工作之一。

    Lu C等使用芯片技术检测cD₄T细胞的基因表达谱，研究发现，寒证和热证之间有29个分化表达基因，7个在寒证中表达明显上升。生物网络、IPCA算法等发现寒证与Toll样受体信号通路有很大关系。热证相关通路包括钙信号通路；细胞黏附分子；PPAR信号通路；脂肪酸代谢。Ma T等分析了一个有l6个家庭成员的典型寒证家族中的9个患者(5个重度，4个轻度)和5个正常人的基因表达谱，最终从5 062个基因中筛选T25个差异表达基冈。

    运用SELDl蛋白芯片技术，赵健等对建立新的中医肺癌辨证模式进行了探索，获得了肺癌气阴两虚和气滞血淤患者血清的蛋白质指纹图谱，并筛选出6个血清差异蛋白质；赖梅生等发现阴虚内热型系统性红斑狼疮(SLE)在治疗前、中、后期与对照组比较均存在PBMC蛋白表达模式的显著差异，提示了运用SELDl蛋白芯片对SLE进行辅助诊断的可能性。

    迄今，运用芯片技术对中医证候的研究主要集中在寒证与热证，实证与虚证等典型证候的研究，证候动物模型的研究也刚刚起步。研究往往受到证候标准、芯片的可靠性和费用等的影响，且尚未见到基于细胞芯片和组织芯片的证候研究报道。如何开展大样本、多中心的证候系统生物学合作研究，阐明证候的生物学基础仍是今后中医基础理论研究的方向之一。

    2．针灸针灸的治疗作用是建立在经络理论的基础上的。通过生物芯片检测针灸的不同方法、频率和强度对不同穴位的作用，所致不同组织基因转录和蛋白调控水平的变化，能够用以探讨经脉与脏腑间的相关联系是否具有特异性和因果关系，增强我们对针灸经络本质的认识。而且，将有助于针灸的作用机制研究。

    2．1针刺Yin l M等以来源于针灸治疗的哮喘大鼠和针灸治疗对照组大鼠的肺组织建立了基因表达系列分析的标签基因库，比较并分析了针灸治疗对哮喘大鼠肺的基因表达谱的影响。结果表明，对照组和哮喘组基因库之间总共有186个分化表达标签，哮喘组与针灸治疗哮喘组有l30个，对照组和针灸治疗对照组有l44个。很多基因与免疫反应和对类固醇激素刺激的反应相关。

    曲怡等应用基因芯片技术研究电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织基因表达谱的影响。结果局灶性脑缺血再灌注大鼠与假手术组大鼠脑组织基因表达谱相比，有175个差异表达基因；电针组与局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织基因表达谱相比，有74个差异表达基因，其中26个基因表达增高，48个基因表达下调。表明研究中筛选出的大量差异表达基因可能参与脑缺血再灌注后脑损伤的发生发展过程，并参与了针灸抗损伤的机制。

    2．2灸法吴焕淦等应用基因芯片检测大鼠结肠组织差异表达基因，以探讨隔药灸治疗溃疡性结肠炎的作用机制。结果筛选出l74条在溃疡性结肠炎大鼠结肠中异常表达、隔药灸治疗后得到调节的差异表达基因，其中28条在溃疡性结肠炎大鼠中表达下调的基因经隔药灸治疗后表达升高，146条上调基因经隔药灸治疗后表达降低。提示大鼠溃疡性结肠炎的发生涉及多种基因表达差异，隔药灸可通过调节诸多基因的表达，起到治疗作用。

    3．中药如上所述，由于生物芯片具有高通量、快速、并行、特异性较强的特点，不仅为中药的药理作用及其机制研究提供了新的手段，而且使中药在高通量的药靶筛选、巾药及其成分鉴定、质量控制以及毒副作用评价等方面也有广泛的应用前景。

    3．I中药有效成分筛选、作用靶标(药靶)及机制的研究在我国，中医中药的临床应用具有数千年历史，尤其是对一些疑难杂症，中药有着良好疗效和独特的发展优势。然而，中药成分复杂，如何分离鉴定药物的有效成分并从大量的靶分子中发现可靠的药靶是一个难题。高通量生物芯片能够快速筛选出中药复杂成分及其效应图谱，为认识中药作用的靶分子，阐明药物作用的分子机制提供了有效的工具。

    Xie Z Q等用cDNA芯片和适时定量RT—PcR探讨银杏叶提取物降低血脂机制的研究中发现，1 264个基因表达量有变化，涉及脂肪代谢、纤维蛋白生成、白细胞聚集等生物学途径，提示这些过程可能参与了银杏叶降低细胞胆固醇代谢的调节。王东生等检测动脉栓塞患者在用大黄蛰虫丸治疗前后的基因表达谱，发现血小板o044个基因上调，299个基因下调；单核细胞00252个基因上调，299个基因下调，提示这些基因涉及离子通道和转运蛋白，凋亡相关蛋白，DNA合成、修复、转录因子，细胞受体，细胞信号转导蛋白，蛋白质翻译与合成等生物学通路。

    3．2中药毒副作用评价对药物进行毒性评价，是药物筛选过程中十分重要的一环。目前多采用动物实验来确定药物的潜在毒性，但传统毒性评价花费大，周期长。通过比对有毒物质的基因表达谱，可以从分子表达特征上为准确、快速、高效地评价中药复方及其组成分的毒理学研究提供有效的评价手段。例如，李丰衣等应用基因表达谱芯片研究黄药子和千里光对小鼠肝脏的毒性机制，发现黄药子对肝脏CYP2A和CYP3A家族，千里光对CYP3A家族有明显的诱导作用，可导致肝细胞核酸与蛋白合成受阻。从而说明利用基因芯片检测中药毒副作用、预测化合物毒性或对毒性物质进行分类是可行的：生物芯片在中药领域的运用有可能改变传统的毒理学研究方式：

    3．3中药鉴定及质量控制准确鉴定中药并进行质量控制是中医临床安全有效用药的保障。中药及复方具有多种成分(组分)，常规的鉴定方法显得力不从心。采用高效液相色谱或气相色谱等方法，从化学角度建立中药或复方的指纹图谱已成为共识。近年来，鉴于高通量生物芯片检测技术的发展，国内外学者已开始研究使用生物芯片对中药进行鉴别。例如，Sze S c等用JDNA芯片成功的将铁皮石斛从伪劣品中鉴别出来，从而说明DNA芯片是鉴定巾药来源的高通量可靠方法。陈学东等用蛋白芯片检测地龙的抗鼻咽癌蛋白组分，最终得到8个蛋白质／肽分子量峰，说明运用蛋白芯片技术，可以较快地建立地龙水溶性蛋8 000—14 000Da抗鼻咽癌组分的肽成分质量指纹图，为进一步分离、纯化中药地龙中抗鼻咽癌有效肽分子提供了实验依据。

    展望

    生物芯片技术的出现是包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和生物信息学的系统生物学研究领域的一个革命性的里程碑，因其高通量、大规模、平行性分析和自动化程度高等优点得到越来越多的应用。由于系统生物学研究的方法学内容与中医的整体观、辨证观有许多相似之处，近年来生物芯片技术被广泛运用于探讨中医基础理论的生物学基础，中药、针灸的疗效及作用机制等中医药研究，并能够以高通量检测手段实证大量新的假说。随着大规模数据的产生和分析技术的提高，研究中医药的模式正在悄然发生变化。尽管其目前还存在着如价钱昂贵、特异性和灵敏度不够高、样品处理过程繁琐等缺点，但必须看到芯片技术的应用，客观上能够促进中医药研究的发展。

    中医药研究水平的提高在很大程度上依赖于研究技术和研究方法的不断发展。近年来，新的生物芯片技术平台不断出现，例如基于适时定量PcR和芯片技术结合所产生的适时定量PCR芯片，结合了芯片高通量和适时定量PCR准确性的优点，一次精确检测几十到几百个不同基因，有超过100种不同信号转导通路或疾病研究的方向可供选择。而以microRNA为代表的J、RNA可以在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达。除microRNA表达谱芯片外，最新推出的microRNA适时定量PCR芯片、lncRNA表达谱芯片，以及基于Illunfina GA IIx的新一代测序技术都可用于非编码RNA的研究等。这些新的生物芯片技术必将在中医药研究领域中得到应用，为促进中医药的现代化进程做出应有的贡献。