藏药超微粉与普通粉显微观察及薄层色谱对比研究
核心提示： 超微粉技术又叫细胞级粉碎技术，是近几年新兴的中藏药加工高新技术，它是以打破动植物类药材细胞壁(膜)，使药材细粉粒径达到5一lOlxm(传统加工的药粉粒径在150—2001．tm)，超微粉技术是一种纯物理过程，粉碎过程中藏药材
超微粉技术又叫细胞级粉碎技术，是近几年新兴的中藏药加工高新技术，它是以打破动植物类药材细胞壁(膜)，使药材细粉粒径达到5一lOlxm(传统加工的药粉粒径在150—2001．tm)，超微粉技术是一种纯物理过程，粉碎过程中藏药材不发生任何化学变化，不改变药材本身的药效物质基础，传统粉碎技术由于药粉粒径较大，有效成分释放率较低，超微粉碎后，由于细胞完整性被打破，细胞内的有效成分能够充分释放出来，使药物起效更加迅速。传统粉碎工艺药材细粉粒径分布范围广，均匀性差，影响疗效的稳定发挥；超微粉的药材粉碎粒度分布范围小，粒度更均匀，提高了产品质量和疗效的稳定性。藏药80％都是生药粉直接入药，用超微粉制成的藏药制剂不但可达提高其有效性，还可以减少服用量和吸收速率，意义重大。本文分别利用显微技术和薄层层析技术研究超微粉和普通粉的细胞破碎和化学成分溶出情况，直观了解超微粉的优点和推广的必要性。
1药品、仪器与试剂
1．1药品：六味安消片的普通粉和超微粉样品，由本所制剂实验室提供；山柰对照药材、大黄酚、大黄素对照品、土木香内酯、没食子酸对照品(121504—200401、110796—200514、110756-200110、110760—200507、110831—200302中国药品生物制品检定所提供)。硅胶G、硅胶GF2、硅胶H由青岛海洋化工厂生产。
1．2设备仪器：MZ30型超微粉碎机、XSP—EMED双目生物显微镜、三用紫外分析仪、超声仪(功率：220V，50kHz)
1．3试剂：水合氯醛、乙醚、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯、水为纯化水。
2方法与结果
2．1组织形态的显微观察
分别取样品超微粉、普通粉粉末适量，粉末制片，置显40倍微镜下观察发现，两种粉体的显微特征，在同样放大倍数下有很大差异，原药粉在显微镜下能明显观察到完整的薄壁细胞，长圆形或长多角形，含扇形菊糖块。淀粉粒圆形、椭圆形或类三角形，直径10—30lxm，脐点及层纹不明显，偶见复粒，由2～3分粒组成。草酸钙簇晶及碎块，直径60—1401*m。内果皮石细胞长100—2001．Lm，直径20～801a,m．内果皮纤维束，纤维长150～3201．tm。网纹导管较多，具有缘纹沟，菊糖结晶多见。木栓细胞壁薄，呈长方形。油细胞呈长圆形，含黄棕色油状物。(见图1)
经超微粉碎后，粉末颗粒大小均匀，不见原药材形貌特征，显微镜下鉴别观察已经看不到完整的组织细胞，变现为不规则的小颗粒充满视野，呈淡黄色，并可见网纹导管碎片散在，偶见淀粉粒、草酸钙簇晶。(见图2)
2．2超微粉和普通粉的薄层色谱对比：
2．2．1取超微粉与普通粉各5．0g，各加乙醚50mL，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，分别作为供试品溶液。另取山奈对照药材粉末0．5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60—90°C)一甲苯一乙酸乙酯一甲酸(15：4：2：0．5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰，(见图3)
1．山柰对照药材；2．六味安消片普通粉；
3．4．5．六味安消片超微粉；6．阴性
2．2．2取超微粉与普通粉各2．5g，加甲醇20mL，浸渍1h，滤过，取滤液10mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加lmL盐酸，水浴加热回流30rain，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿2mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0．1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品、大黄酚对照品，分别加甲醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各8uL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶H板上，以石油醚(60—90％)一甲酸乙酯一甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图4)。
1．大黄对照药材；2．大黄素、大黄酚对照品；
3．六味安消片普通粉；4．5．6．六味安消片超微粉；7．阴性
2．2．3取超微粉与普通粉各5．0g，加乙醚50mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取土木香内脂对照品，加甲醇制成lmL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液和上述对照品溶液各5ul分别点于用0．25％硝酸银制备的硅胶G薄层板上，以石油醚(60—90~C)一甲苯一乙酸乙酯一甲醇(15：2：2：O．5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％茴香醛硫酸溶液，105％加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图5)。
1．土木香内酯对照品；2．六味安消片普通粉；
3．4．5．六味安消片超微粉；6．阴性
2．2．4取超微粉与普通粉各3．5g，加乙醇10mL，超声处理20min，上清液作为供试品溶液。另没食子酸对照品，加乙醇制成lmL含0．5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5tzL，分别点于同一以甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一乙酸乙酯一甲酸(6：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，105~C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。超微粉斑点明显比原药粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图6)。
3结果讨论
一般情况下药用有效成分主要存在于细胞内，在细胞完整无损的状态下，有效成分只能透过细胞壁和细胞膜释放出后才能被利用。完整的细胞壁和细胞膜对有效成分的释出形成阻力，这种阻力随细胞团内细胞数量的增多而增大。为消除这种阻力需要对药材采用超微粉碎工艺将细胞打破，以使细胞壁与成分分离，细胞内的有效成分可直接接触溶媒而溶出，而不再需要通过以往的透壁释放过程(本实验显微图谱很清楚)。一方面使其粒度更加细微均匀，比表面积增加，孔隙率增大，提高药物的溶出速度，有利于药物的吸收；另一方面95％以上的细胞破壁率使药物细胞中的有效成分直接暴露出来并进入体液，从而达到用药剂量更小，生物利用度更高，药物发挥作用更迅速，药效更强之目的。
在薄层色谱鉴别中，超微粉的供试品溶液比普通粉的供试品溶液的斑点清晰，可见在样品前处理方法、点样量、展开剂等完全相同的条件下超微粉的提取效率明显优于普通粉。
藏药工业生产从作坊式生产，逐步向机械化、工业化、现代化过渡，超微粉碎工艺技术为积极发展起来的中藏药现代化制剂的研制指引了一个方向，必将呈现出强大的生命力。
1药品、仪器与试剂
1．1药品：六味安消片的普通粉和超微粉样品，由本所制剂实验室提供；山柰对照药材、大黄酚、大黄素对照品、土木香内酯、没食子酸对照品(121504—200401、110796—200514、110756-200110、110760—200507、110831—200302中国药品生物制品检定所提供)。硅胶G、硅胶GF2、硅胶H由青岛海洋化工厂生产。
1．2设备仪器：MZ30型超微粉碎机、XSP—EMED双目生物显微镜、三用紫外分析仪、超声仪(功率：220V，50kHz)
1．3试剂：水合氯醛、乙醚、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯、水为纯化水。
2方法与结果
2．1组织形态的显微观察
分别取样品超微粉、普通粉粉末适量，粉末制片，置显40倍微镜下观察发现，两种粉体的显微特征，在同样放大倍数下有很大差异，原药粉在显微镜下能明显观察到完整的薄壁细胞，长圆形或长多角形，含扇形菊糖块。淀粉粒圆形、椭圆形或类三角形，直径10—30lxm，脐点及层纹不明显，偶见复粒，由2～3分粒组成。草酸钙簇晶及碎块，直径60—1401*m。内果皮石细胞长100—2001．Lm，直径20～801a,m．内果皮纤维束，纤维长150～3201．tm。网纹导管较多，具有缘纹沟，菊糖结晶多见。木栓细胞壁薄，呈长方形。油细胞呈长圆形，含黄棕色油状物。(见图1)
经超微粉碎后，粉末颗粒大小均匀，不见原药材形貌特征，显微镜下鉴别观察已经看不到完整的组织细胞，变现为不规则的小颗粒充满视野，呈淡黄色，并可见网纹导管碎片散在，偶见淀粉粒、草酸钙簇晶。(见图2)
2．2超微粉和普通粉的薄层色谱对比：
2．2．1取超微粉与普通粉各5．0g，各加乙醚50mL，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，分别作为供试品溶液。另取山奈对照药材粉末0．5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60—90°C)一甲苯一乙酸乙酯一甲酸(15：4：2：0．5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰，(见图3)
1．山柰对照药材；2．六味安消片普通粉；
3．4．5．六味安消片超微粉；6．阴性
2．2．2取超微粉与普通粉各2．5g，加甲醇20mL，浸渍1h，滤过，取滤液10mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加lmL盐酸，水浴加热回流30rain，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿2mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0．1g，同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品、大黄酚对照品，分别加甲醇制成每lmL含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各8uL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶H板上，以石油醚(60—90％)一甲酸乙酯一甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图4)。
1．大黄对照药材；2．大黄素、大黄酚对照品；
3．六味安消片普通粉；4．5．6．六味安消片超微粉；7．阴性
2．2．3取超微粉与普通粉各5．0g，加乙醚50mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取土木香内脂对照品，加甲醇制成lmL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液和上述对照品溶液各5ul分别点于用0．25％硝酸银制备的硅胶G薄层板上，以石油醚(60—90~C)一甲苯一乙酸乙酯一甲醇(15：2：2：O．5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％茴香醛硫酸溶液，105％加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。超微粉斑点明显比普通粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图5)。
1．土木香内酯对照品；2．六味安消片普通粉；
3．4．5．六味安消片超微粉；6．阴性
2．2．4取超微粉与普通粉各3．5g，加乙醇10mL，超声处理20min，上清液作为供试品溶液。另没食子酸对照品，加乙醇制成lmL含0．5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5tzL，分别点于同一以甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一乙酸乙酯一甲酸(6：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，105~C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。超微粉斑点明显比原药粉斑点清晰。阴性对照无干扰。(见图6)。
3结果讨论
一般情况下药用有效成分主要存在于细胞内，在细胞完整无损的状态下，有效成分只能透过细胞壁和细胞膜释放出后才能被利用。完整的细胞壁和细胞膜对有效成分的释出形成阻力，这种阻力随细胞团内细胞数量的增多而增大。为消除这种阻力需要对药材采用超微粉碎工艺将细胞打破，以使细胞壁与成分分离，细胞内的有效成分可直接接触溶媒而溶出，而不再需要通过以往的透壁释放过程(本实验显微图谱很清楚)。一方面使其粒度更加细微均匀，比表面积增加，孔隙率增大，提高药物的溶出速度，有利于药物的吸收；另一方面95％以上的细胞破壁率使药物细胞中的有效成分直接暴露出来并进入体液，从而达到用药剂量更小，生物利用度更高，药物发挥作用更迅速，药效更强之目的。
在薄层色谱鉴别中，超微粉的供试品溶液比普通粉的供试品溶液的斑点清晰，可见在样品前处理方法、点样量、展开剂等完全相同的条件下超微粉的提取效率明显优于普通粉。
藏药工业生产从作坊式生产，逐步向机械化、工业化、现代化过渡，超微粉碎工艺技术为积极发展起来的中藏药现代化制剂的研制指引了一个方向，必将呈现出强大的生命力。
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