壮药假药药材质量标准研究

 假枸又称假蒌、哈枸、假老等，过去一直当作常见的祛风湿类中草药使用，是中华跌打丸的重要原料之一，并收载于《中国药典》2010版附录中。近年来人们发现，假荀资源丰富、药食两用，是极具民族特色的植物药，已有生药学及化学成分等的研究报道。为进一步完善其质量标准，更好地开发利用资源，本文系统地进行了相关研究，结果如下。
1材料与仪器
1．1药材与试剂假茹采自广西各地(见表1)，经广西中医药大学蔡毅教授鉴别为Piper sarmentosum Roxb．的干燥地上部分。a一细辛脑对照品(中国食品药品检定研究院，批号：10298—0001)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。
 
1．2仪器1100高效液相色谱仪系统(美国Agilent)；半自动轮转切片机(Leica RM2145，山海天呈科技有限公司)；光学生物显微镜(DM2500，德国徕卡仪器公司)；电子分析天平(BP211D，德国赛多利斯)；台式电热恒温干燥箱(GZX—DH一26X30一TBS，上海跃进医疗器械厂)；箱式电阻炉(sXZ一4一lO，上海实验仪器厂有限公司)；数显恒温水浴锅(HH—S4，金坛市医疗仪器厂)。
2实验方法与结果
2．1  性状鉴别通过对多地采集的标本，用性状鉴别法进行研究，汇总其性状鉴别特征如下：本品茎呈圆柱形，表面有细纵棱，节上有不定根。叶多皱缩，展开后呈阔卵形或近圆形，长6～14cm，宽5～13cm，基部浅心形；上面棕绿色，下面灰绿色，有细腺点；7条叶脉于叶背突出，脉上有极细小的粉状短柔毛；叶柄长2—5cm，叶鞘长为叶柄的一半；有时可见与叶对生的穗状花序。气香，味辛辣。
2．2显微鉴别通过对多地采集的标本，用显微鉴别法进行研究，汇总其显微鉴别特征如下。
2．2．1茎横切面表皮细胞1列，外被角质层；非腺毛由1～2个细胞组成。皮层外侧有数列厚角组织，断续呈环。中柱维管束20～25个，环列；韧皮部外侧有半圆形纤维束；木质部较宽，导管径向排列；髓鞘纤维束明显。髓部宽广，髓中维管束5～7个，环列；中央有1分泌道，直径245~460Ixm，可见棕黄色分泌物。皮层、髓部均有油细胞散在；细小淀粉粒可见(见图1)。
2．2．2本品粉末灰绿色分泌道碎片易见，内含细小颗粒状分泌物。油细胞类圆形，直径23～38um。石细胞类圆形、类长方形，直径26~79Van，壁孔明显。非腺毛由1-2个细胞组成，长42~87van。纤维、螺纹导管或梯纹易见(见图2)。
 
1．表皮2：厚角组织3．皮层4．内皮层5．纤维束6．韧皮部7．木质部8．环髓纤维9．髓部10．髓中维管束11．分泌道   
1．epidermis 2．collenchyma 3．cortex 4．Endodermis 5．fiber bundle
 6．phloem 7．xylem 8．pith-surrounded fiber 9．pith 10．vascular bundle
inpith 11．secretory
    图1假药茎横切面特征图
    Fig．1 Characteristics ofcross section ofPiver
    sarmentosum Roxb Stem     
 
1：分泌道碎片2.油细胞3．石细胞4．非腺毛5．纤维6．导管7．表
皮细胞8．淀粉粒
1．secretorycanalfragment2．Oil cells 3．sclereid4．non-glandular
 hair 5．fiber 6．vessel 7．epidermal cells 8．starch    一
    图2假药粉末特征图
Fig．2 Characteristies ofPier sarmentosum Roxb．powder
2．3薄层色谱鉴别根据假茹所含有化学成分的类型，对不同的提取方法、展开系统及显色剂进行反复考察，稳定的薄层鉴别方法如下：取本品粉末1g，加甲醇20ral，加热回流lh，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解。作为供试品溶液。另取假苟对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取仅一细辛脑对照品适量，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各101xl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷一丙酮(20：3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的磷钼酸乙醇溶液，在105~C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图3)。
 
2．4检查
2•4•1水分照中国药典2010年版一部附录水分测定法(附录Ix H第二法)甲苯法测定，15批假茹水分测定结果为8•1％～12．0％(见表2)。初步拟定假茹水分含量不得超过13．0％。
2•4•2总灰分照中国药典2010年版一部附录灰分测定法(附录Ix K)测定，15批假琦总灰分测定结果为11•0％～16．0％(见表2)。初步拟定假苟总灰分含量不得超过17．O％。
2•4．3酸不溶性灰分照中国药典2010年版一部附录灰分测定法(附录Ix K)测定，15批假琦酸不溶性灰分测定结果为0．4％一3．1％(见表2)。初步拟定假茹酸不溶性灰分含量不得超过3．7％。
2．5浸出物照水溶性浸出物测定法项下的冷浸法(中国药典2010年版一部附录x A)测定，15批假茹水溶性浸出物测定结果为18．6％一28．2％(见表2)。初步拟定假茹浸出物含量不得少于15．0％。
2•6 a 一细辛脑的含量测定  a 一细辛脑为假茹的主要成分，在其挥发油含量中含量高达40．33％，对本品中a一细辛脑进行含量测定，方法及结果如下。
2．6．1  色谱条件采用phenomenex ODS2柱(250mm×4•60 mm，5um，)；流动相为乙腈一0．05％磷酸溶液(49：51)；流速1．0 mL•min～；检测波长313 nm；柱温30℃；进样量10 IxL。在上述条件下，各成分无干扰且完全分离，理论板数按仅一细辛脑计算大于l×104，a一细辛脑对照品和假苟供试品色谱图见图4。
2．6．2溶液的制备取a一细辛脑对照品1．95 nag，精密称定，置10 m1量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成0．195 mg•mL。的a一细辛脑对照品溶液。称取假茹干燥粗粉O．3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20 ml，回流3 h，放冷，用50％甲醇补足损失的重量，用孔径为O．45Ixm的微孔滤膜过滤，续滤液为供试品溶液。
2．6．3样品测定不同采收时间采收的假茹药材15批，
 
 
图4  a一细辛脑对照品(A)和假药供试品(B)溶液色谱图a—o【一细辛脑Fig．4 HPLC Chromatogram of a-asaron~(A)and sample(B)a-a-asarone
 
2．7指纹图谱的研究指纹图谱能较全面地反映生药所含内在化学成分的种类与数量，更加有效地体现了生药成分的复杂性，因而在评价生药内在质量方面更客观，更符合传统的中医药理论。本文收集了广西产(桂东、桂南、桂西、桂中)样品15批，用高效液相色谱法对假茹指纹图谱进行研究，结果如下。
2．7．1溶液的制备精密称取a 一细辛脑对照品4．10mg，置10ml量瓶中，用适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0．4100mg•m1“的对照品溶液。取假茹药材干燥粉末约0．3g，精密称定，精密加入50％甲醇20ml称重，回流提取1h，放冷至室温，加50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2．7．2色谱条件采用phenomenex c180DS2柱(250 mm×4．6 mm，5um)；流动相为乙腈一0．05％磷酸，梯度洗脱(0—15 min：5％～20％乙腈；15～25 min：20％乙腈；25~55 min：20％～47％乙腈；55—65 min：47％～58％按“2．6．2”项下方法制成供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液各10ul按“2．6．1”项条件进样，测定峰面积，按外标法计算仪一细辛脑的含量。假菏中仪一细辛脑含量在0．036％一0．507％之间(见表2)。
乙腈；65—70 min：58％～70％乙腈；70—90 min：70％一85％乙腈；90—100 min：85％～85％乙腈)；流速1．0ml•rain～；检测波长258 nm；柱温30％；进样量10ul.
2．7．3指纹图谱与共有峰的确定按“2．7．2”项方法检测15批假茹药材的指纹图谱。将测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件，经校正，将谱峰自动匹配，生成对照图谱；通过中药指纹图谱相似度评价软件得假茹HPLC指纹谱共有模式图(见图5)。结果表明，其中有15个主要色谱峰(占总峰面积90％以上)是15批假茹药材所共有的，以峰面积较大且分离度较好的12号峰(仪一细辛脑)作为参照峰s。
2．7．4指纹图谱的相似度分析将15批药材样本图谱与对照图谱比较，计算相似度。结果显示，4批假琦药材相似度大于0．70，7批假茹药材相似度大于0．80，其余4批假茹药材相似度大于0．90。
 
3讨论
    a一细辛脑为近年来的研究热点之一，具有很好的治疗哮喘、毛细支气管炎、癫痫、惊厥和降血脂等疾病的作用。假茹挥发油的主要成分为a一细辛脑，含量高达40．33％，以其作为化学对照品进行薄层鉴别，具有一定的合理性。中药材含有多种成分，常共同发挥临床疗效，有时甚至具有双向调节作用，很难确定某一化学成分即是中医用药的唯一有效成分。况且，已有研究表明假茹中仪一细辛脑会受产地、采收季节、加工方法等影响，故含量测定以a一细辛脑为指标，只能间接地控制其质量，应与浸出物等指标联合使用。而指纹图谱的应用，较好地克服了单一成分含量测定的不足。通过指纹图谱特征，能有效鉴定样品的真伪或产地；通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对稳定。假茹指纹图谱的研究，虽然取得了一定成果，但要用于其质量监控尚需进一步完善。
  综上所述，本研究的结果，可为进一步完善假茹药材质量标准提供实验基础。
 

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