野生灵芝资源

    灵芝属担子纲菌，多孔菌科植物，灵芝属真菌的总称。灵芝作为我国传统的名贵滋补中药，受到国内外的普遍关注。它具有食用和药用两种功能，在我国已有两千多年历史，目前我国灵芝年产量已超过l万吨。灵芝具有抗衰老、提高机体免疫力、提高肝脏的解毒和排毒、抑制恶性肿瘤增长、抗放射线和有害化学物、镇静和镇痛等功能。灵芝的主要有效成分为灵芝多糖和三萜类化合物，目前评价灵芝质量的标准存在差异，《中国药典》中以灵芝多糖含量的高低来评价灵芝质量的好坏，在日本则以灵芝酸含量的高低来控制灵芝的质量。

    灵芝酸属于灵芝三萜类，是近年来从灵芝中分离得到的另一类具有广泛药理活性的物质，是当今灵芝研究的又一热点。然而，野生灵芝资源有限，人工栽培的灵芝由于产地、栽培技术、采收条件等的差异，所以市场上的灵芝产品良莠不齐。本文通过对中国灵芝主产区山东聊城、江苏南通、福建武夷山、浙江龙泉、吉林长白山和安徽大别山的灵芝样品中的灵芝多糖、总三萜类化合物以及灵芝酸A、B含量进行比较，研究六大不同产地灵芝的质量差异性，为灵芝原料的采购提供可靠的理论依据。

1材料、仪器及试剂

1．1材料

    本实验所用灵芝都为真菌赤芝，分别取自山东聊城、江苏南通、福建武夷山、浙江龙泉、吉林长白山和安徽大别山。除了山东聊城的以棉籽壳作为袋料进行栽培外，其它地方都是椴木栽培。

1．2仪器与试剂

  Waters Acquity UPLC，KQ一250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AB265一S／10万电子天平(梅特勒一托利公司)；TU一1900型紫外一可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；标准品灵芝酸A，灵芝酸B(上海同田生化技术有限公司提供，纯度均在98％以上)；熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所)；乙腈(色谱纯)；重蒸馏水；氯仿、磷酸、石油醚、乙酸乙酯、无水甲醇等试剂均为分析纯。

2分析方法与检测结果

2．1  灵芝酸A和灵芝酸8含量的测定

2．1．1色谱条件

    色谱柱为Waters X—BridgeCl8(4．6mm X l50mm，3．5txm)；检测波长252nm；采用梯度洗脱，液相的梯度比与时间关系如表l所示；柱温为400C；流速：0．4ml／min；进样量l0¨1。在此色谱条件下，灵芝酸A和灵芝酸B混合对照品和灵芝药材的UPLC谱图如图l所示。

表1不同时间洗脱的梯度比

    1．灵芝酸A：2．灵芝酸B图1混合对照品(A)和灵芝药材(B)的UPLC谱图

2.l-2标准曲线的制备

1    精密称取适量的灵芝酸A、灵芝酸8对照品，分别置lOml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成灵芝酸A、灵芝酸8，质量浓度分别为l．802m9／ml和LIl20mg／ml的单一成分对照品储备液。精密量取上储备液各8．0m1置于同一25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成灵芝酸A、灵芝酸B混合对照品储溶液．质量浓度分别为0．577mg／ml和0．326mg／ml。密量取对照品储备液2．0ml至10ml容量瓶中，用甲嘛释至刻度，摇匀，得到灵芝酸A、B质量浓度分别渤0.l00mg／ml和0．065mg／ml的混和对照品溶液。

    按照参考文献的方法，分别精密量取混合对照储备液0．5、1．0、2．0、4．0、6．0、8．0ml至10ml容量瓶中，配制一系列对照品溶液。各取上述对照品溶液20μl进样，按照“2．1．1”项下色谱条件进行分析。以漱度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行嘲归计算，结果表明，灵芝酸A、灵芝酸8的回归方程，分别为Y=1．9E+07X一122 000，R2：0．999 6：Y：：ZOE+07X+139 583，R2=0．999 1。灵芝酸A和灵芝酸B分别在28．85～400．8，16．30～260．8¨g／ml线性关系良好。

2-1．3供试品溶液的制备

    按照参考文献的方法，对供试品进行提取。最终提取物中加入少量甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，经0．45m微孔滤膜过滤，取续滤液．即得：

2.1．4精密度试验

    按照2．1．1项下的色谱条件，取灵芝酸A和灵芝酸B混合对照品溶液，连续进样6次，分别记录峰面积，灵芝酸A和灵芝酸8峰面积的RSD值分别为1.6%和2．4％。表明仪器精密度良好。

2.1．5重复性试验

    分别精密称取安徽大别山灵芝样品6份，按2.1．3供试品溶液制备和2．1．1色谱条件项下方法操作．计算灵芝酸A、灵芝酸8含量的RSD分别为3.1%l．8％。表明该方法的重复性良好。

2.1.6稳定性试验

    取安徽大别山供试品溶液，置于室温下，于0、2、4、6、8、10、12、24h取溶液10出检测，记录峰面积，结。黑表明，24h内供试品溶液稳定性良好，灵芝酸A和灵芝酸B峰面积的RSD分别为0．9％和l．4％。

2.1。7回收率试验

  取已知含量的武夷山灵芝药材约0．25g共9份，精密称定，分为3组，分别精密加入低、中、高浓度的灵芝酸A和灵芝酸8对照品溶液，按2．1．3和2．1．1项下方法配制供试品溶液后用HPLC方法检测，记录峰面积，计算回收率。

2．1．8不同产地灵芝药材中灵芝酸A及灵芝酸8含量测定

    取六种不同产地的灵芝药材粉末，按2．1．3供试品溶液制备和2．1．1色谱条件项下方法操作进行分析，六种不同产地灵芝药材中灵芝酸A和灵芝酸8测定所示。

2．2灵芝多糖的含量测定

2．2．1灵芝多糖的提取

    取本品粉末约29，精密称定，置索氏提取器中，加水90ml，加热回流提取至提取液无色，提取液转移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取10ml，加入乙醇l50ml，摇匀，4。C放置l2h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解转移至50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀即得。

2．2．2标准曲线的制备

    硫酸溶液(80％)：取80ml浓硫酸加入到loml左右水中，混匀，冷却后稀释至100ml。

    硫酸蒽酮溶液：精密称取蒽酮0．19，加80％的硫酸溶液100ml使其溶解，摇匀。

    葡萄糖标准储备液：准确称取葡萄糖对照品25．0m9，加水溶解，并定容至25ml，混匀，置冰箱保存。此溶液1ml含1．0ra9葡萄糖。

    葡萄糖对照品使用液：吸取葡萄糖标准储备液1．0ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。此溶液lml含葡萄糖0．10m9。

    标准曲线的绘制：准确吸取葡萄糖对照品使用液0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2m1置10ml具塞试管中，加水至2．0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀，置水浴中加热15min，取出，放人冰水中冷却15min，以相应的试剂为空白，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

    样品含量测定：精密量取供试品溶液2ml，置loml具塞试管中，按标准曲线的制备项下的方法自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中葡萄糖的含量(mg)，计算，即得。

2．3灵芝总三萜含量测定

2．3．1标准曲线的制备

    按照参考文献的方法，对六种不同产地灵芝药材中总三萜含量进行测定，绘制标准曲线并进行回归计算。对照品在0．00～0．14m9范围内与吸光度值呈良好的线性关系，其线性回归方程为Y：0．215 8X一0．001 8，相关系数r=0．998 6。

2．3．2灵芝三萜的提取

    灵芝三萜的提取方法：称取干燥灵芝粗粉2009，按照参考文献的方法对灵芝三萜进行提取，得灵芝三萜粗提物。

    取灵芝粗提物约10．OOm9，溶于10．00ml乙酸乙酯中。按照2．3．1项下方法配制待测样品溶液并测定样品溶液的吸光度。

3讨论

    灵芝三萜在免疫调节和抗肿瘤病方面具显著效果，其含量的高低直接决定了灵芝产品的抑肿瘤效果的好坏。在灵芝总三萜中灵芝酸起着非常重要的作用，是灵芝的主要有效成分之一[10。1 2|，其中灵芝酸A、B的含量占50％以上。，因此测定灵芝酸A、B的含量可以作为判断灵芝质量的科学依据。灵芝酸A含量大别山为最高(7．254m9／g)，龙泉次之(6．658m9／g)，山东(1．959m9／g)最低。灵芝酸8含量龙泉(4．574m9／g)为最高，大别山最低(0．337m9／g)。从单独测定灵芝酸A、B含量看，各产地灵芝酸含量差异较大，可能与栽培灵芝的气候、培养基等环境有关；总三萜含量测定中，结果是大别山灵芝总三萜含量最高，有可能因为其栽培的环境因素有利于总三萜的积累。

    灵芝多糖具有提高机体免疫力、抗肿瘤、消除体内自由基、降血糖、降血脂一¨一等作用。在六大灵芝产地中，山东地区的灵芝多糖含量最高(9．08％)，武夷山次之(7．38％)，大别山最低(1．85％)。采自山东聊城的灵芝是唯一由棉籽壳作为袋料培养的，棉籽壳作为袋料培养灵芝可能会增加多糖的含量。

    本研究综合评价了灵芝的药效物质，为国内灵芝主要产地的质量提供依据，并为培养高品质灵芝提供借鉴和参考。

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