酶法在中药提取中的应用进展
核心提示： 酶的反应具有专一性高、催化活性强及作用条件温和等特点。自20世纪以来，酶化学与多学科的相互渗透得到了迅速发展，特别是在医药和食品领域发挥了巨大作用。酶法早期被广泛应用于食品、饲料工业及天然产物的提取，20世
酶的反应具有专一性高、催化活性强及作用条件温和等特点。自20世纪以来，酶化学与多学科的相互渗透得到了迅速发展，特别是在医药和食品领域发挥了巨大作用。酶法早期被广泛应用于食品、饲料工业及天然产物的提取，20世纪90年代，国内许多学者开始将酶的特性与生物细胞的结构联系起来，陆续开展了将生物酶用于天然药物及中药的辅助提取，以达到提高有效成分浸出率的目的，取得了一定的效果。笔者现就近年来酶法在提取中药各类有效成分中的应用作一综述。
1 酶法在中药有效成分提取中的应用
1．1多糖类
在提取多糖的应用中，董氏等选用纤维素酶提取首乌藤多糖成分，有效地软化和溶胀细胞壁，从而改变细胞壁的通透性，在不破坏首乌藤多糖成分结构的同时使其快速浸出，且该工艺较为简单、耗能低、提取效率高，与传统水提醇沉法多糖得率(4．7％)和多糖含量(24．07％)相比，分别提高1．57％和6．96％。廉氏等采用超声波结合复合酶法提取沙枣多糖，因沙枣为果实类药材，沙枣中的果胶会造成提取液黏度增大，极大地影响有效成分的扩散。故在第一阶段通过纤维素酶和果胶酶联用，酶解细胞表面结构及胞间连接物，降低提取液的黏度，使溶于水的胞内多糖浸出率增加；第二阶段通过超声波空化效应对原料的破碎作用，加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于有效成分的溶出。2种工艺的结合不仅提高了提取效果，且二者联用还能弥补彼此间的不足。许氏等通过采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶法与热水浸提法提取竹节参中多糖成分的工艺比较研究，得出复合酶法提取效果较好，多糖得率为14．3％，与热水浸提法多糖成分得率11．61％相比明显提高。最佳工艺条件为料液比1：50，纤维素酶的质量分数1．2％，果胶酶的质量分数1．O％，pH值为5．O，温度为50℃，酶解时间2 h，90℃灭酶和浸提2 h。
1．2黄酮类化合物
许氏等在用酶法提取银杏总黄酮的研究中，由于银杏叶总黄酮在植物细胞中以苷元和苷的形式存在，故不宜以醇水体系提取，而利用转昔酶和糖等糖基供体将极性低的黄酮苷元、黄酮苷转为极性高的黄酮苷，提高了总黄酮在醇水中的提取率。利用Suhong475转苷酶强化银杏叶总黄酮提取的结果表明：温度在50～55℃，pH值为6．0～6．5，反应时间为10 h时，总黄酮的提取率比对照组增加44．0％。欧氏等在用酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺优化中，通过响应面法确定纤维素酶提取绞股蓝中总黄酮的最佳工艺条件为：酶解温度为49℃，pH值为3．9，酶解时间为2．5 h，酶用量为120 u／IllL，总黄酮得率为0．357％，与传统溶剂浸提法的总黄酮得率0．266％相比提高了25．0％。旷氏等经单因素试验和正交试验考察pH、酶解时间、酶解温度、酶的用量4个因素对水酶法与超声相结合提取连翘中总黄酮工艺的影响，结果显示：在纤维素酶的用量为1．2％、pH值为6．0、酶解温度为50℃的条件下酶解4 h，连翘总黄酮的提取率为10．54％。王氏等采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶法提取苦瓜叶中的总黄酮，苦瓜叶总黄酮的提取率可达到3．13％，与直接醇提工艺相比总黄酮提取率提高了30．0％以上，提取工艺为：纤维素酶浓度为0．8 mg／ⅡlL，果胶酶浓度为0．5 mg／mL，提取温度为55℃，提取介质pH值为4．5的条件下酶解140 min。
1．3苷类化合物
郭氏等利用基因工程菌甲醇毕赤酵母生产的漆酶提取黄芪总皂苷，经正交试验优化后，发现漆酶提取的最佳工艺为：漆酶加入量1359 u／g(黄芪粗粉)，pH值为4．0，在40℃的温度下酶解1．5 h，之后补水至总体积为50 mL，最后在100℃温度下提取1．5 h。结果显示，经过漆酶酶处理后的提取率比未经酶处理的提取率提高65．6％。郑氏等采用二次通用旋转试验研究苦杏仁酶水解栀子苷制备栀子苷元的工艺，试验以pH值、反应温度、反应时间和酶加入量4个因素对工艺进行考察，在pH值为5．25、反应温度50．5℃、反应时间90 min、酶加入量1：10的条件下，采用理化性质及核磁共振波谱鉴定产物结构，高效液相色谱峰面积归一化法检测产物纯度。结果显示：产物栀子苷元得率>34．5％，质量分数为99．6％。樊氏等用酶解法与微波法相结合提取积雪草总苷，经正交试验表明，提取最佳工艺条件为：酶解温度45℃，液固比36，酶解时间30min，微波辐射1 10 s。在此条件下积雪草总苷得率为27．10％，分别是水煎煮、索氏提取的124％、183％。耗时分别为上述两方法的1／4、1／6。
1．4生物碱类
李氏等研究不同提取法在提取川乌过程中对生物碱的影响中发现，纤维素酶提取法具有明显的优势。纤维素酶法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0．002 447％、O．244 410％~半仿生提取法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为O．001 735％、0．189 340％：乙醇回流提取法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0．001 869％、O．200 720％。其最佳酶解提取工艺条件为：酶用量3 mg／g，温度为45℃，pH值为4．5，酶解时间为5 h。徐氏等用超声一酶法联合技术提取黄柏中小檗碱，与未经纤维素酶处理的对照组比较，具有提取效率高、省时、高效节能等优点。提取最佳工艺条件为：水浴时间2．5 h，超声功率80％，加酶量20 mg／g，水浴温度60℃。陈氏等“将白英药材经纤维素酶处理后用乙醇回流提取总生物碱，通过正交试验优化酶处理工艺参数。结果显示，温度50℃、酶反应时间3 h、pH值为4．5、酶质量浓度为1．6 mg／L的条件下酶法提取率为传统提取法的5倍。
1．5有机酸类
张氏等用酶法和超声波提取相结合的方法得到杜仲叶中绿原酸提取的最佳工艺条件为：溶剂pH值为5．O、酶解温度为40℃、料液比为1：lO、超声时间为30 min，在此条件下绿原酸提取率可达3．05％。酶法和超声波法结合提取，其绿原酸提取率比单一酶法高5．54％，比超声波提取高16．68％。张氏等通过研究纤维素酶提取车前草中熊果酸的工艺，得出最佳工艺条件：pH值为5．0、酶用量5．0mg／g、酶解温度60℃、酶解时间2．5 h。在此条件下车前草中熊果酸提取率达O．54％。
1．6油类物质
陈氏等对酶法和水蒸气蒸馏提取法提取没药中挥发油成分进行比较研究，结果显示：水蒸气蒸馏一萃取法提取没药挥发油1．1 g，产率为2．2％，占挥发油总量的69．75％；经纤维素酶处理提取挥发油2．1 g，产率为6．O％，占挥发油总量的70．05％。纤维素酶提取所得没药油收率比未经酶处理所得没药油收率提高大约3倍。刘氏等通过对酶法一亚临界水提取沙姜有效成分的研究表明，最佳工艺条件为在温度120℃、压力8 MPa、淀粉酶用量为0．3％、投料量100 g条件下提取20 min，与单纯亚临界水提法相比，精油的提取率提高了lO．0％以上。
1．7萜类化合物
马氏等研究以纤维素酶提取穿心莲内酯，在pH值为5．0、温度为40℃、水浴时间为1．5 h条件下对比加酶(加酶量10 u／g)与未加酶提取对穿心莲内酯提取率的影响，结果加酶法穿心莲内酯提取率为0．321％，未加酶法提取率为O．252％，酶法使穿心莲内酯的提取率提高了27．4％。喻氏等。”探索了纤维素酶辅助提取银杏叶萜内酯，结果经纤维素酶处理后用乙醇提取银杏叶萜内酯总提取率为0．40％，与单纯乙醇提取法相比银杏叶萜内酯的提取率提高了66．67％。
1_8其他成分
苗氏等在国内首次利用植物蛋白酶和糖化酶提取牛蒡中膳食纤维。在加酶量为植物蛋白酶6．O％、糖化酶1．2％、DH值7．0、温度50℃、酶解时间4 h条件下，牛蒡中膳食纤维提取率为63．74％。杨氏等采用1．0％纤维素酶、0．2％果胶酶、1％木聚糖酶，以水为溶剂(加水量为蜂花粉质量的2倍)，在pH值为5．O、温度为50℃、酶解6 h条件下提取蜂花粉中的活性蛋白。结果蜂花粉平均破壁率为94．5％，粗蛋白平均提取率为47．6％。郑氏等用纤维素酶提取老鹳草中的鞣质，结果在相同的工艺条件下，经纤维素酶处理后进行水提取比直接水提取鞣质的含量明显提高。刘氏等在探索中性蛋白酶酶解提取牡蛎牛磺酸工艺条件研究中发现最佳工艺条件为：在温度40℃、加酶量1000 u／g(鲜肉)、pH值为7．2、料液比l：9(g／L)条件下水解5 h，牛磺酸提取量为2．623 mg／g(鲜肉)。徐氏等在酶解法制备鹿茸多肽研究中，通过单因素试验和正交试验得出最佳酶解工艺条件：在温度48℃、加酶量6000 u／g、pH值为7．2、底物浓度为7．5％、胰蛋白酶与复合蛋白酶比1：9(g／L)条件下水解4 h，多肽得率为72．8％。
2酶法提取技术上存在的问题
酶法作为一种提取中药有效成分的新方法，无论在实践还是理论方面均未成熟和完善，存在以下问题：①酶是一类生物催化剂，其活性易受温度、pH值、酶浓度及酶解作用时间等因素影响，这些因素稍有变化，便会影响酶的活性。因此，需根据试验来选择合适工艺条件，严格控制这些因素，以发挥酶的最大作用。如纤维素酶法提取浒苔多糖时需要在加酶量为8．0％、温度40℃、pH值为5．O条件下进行，且提取时间为2．5 h 。而用复合酶提取褐藻糖胶时，加酶量为1．0％、温度30℃、pH值为3．5条件下进行，且提取时间为1．5 h 。②在酶法提取过程中，酶有可能与中药所含某些成分发生反应，产生新的化学物质；在酶的灭活方面也有可能存在残留酶，从而对产物的纯度、得率及制剂疗效、质量检测与控制、制剂的剂型等产生影响。③中药种类繁多，其细胞结构及有效成分不尽相同，需要根据实际情况选择酶的种类，尚无统一的参考标准。④目前酶解法提取中药有效成分的研究大多停留在实验室阶段，且多是针对单味中药的提取，与实际生产与应用还有一定的距离。
3展望
虽然酶解法技术尚不完善，但相对其他提取方法而言还是有许多优点，如可以提高产物提取率，保障产物的纯度、稳定性及活性，对中药成分影响小，缩短提取时间，降低耗能，操作和设备简单，成本低廉等。另外，国内一些学者把酶法与其他一些新的提取工艺如膜分离技术、超声提取技术、微波技术等相结合，取得了一定进展。如刘氏等用复合酶解一微波萃取、超滤相结合的新工艺提取及纯化灰树花多糖，并且对提取和纯化工艺进行了研究；姚氏等用酶法结合超声技术提取纯化菊米总黄酮，提高黄酮类化合物的提取率和含量；孙氏等。”以半仿生一酶法提取半夏白术天麻汤有效成分，体现出中药复方整体、综合、客观的特点；王氏以独创的水提工艺结合生物酶工程、絮凝技术、膜分离和大网格组合大孔吸附树脂技术提取三七总苷，提出了中药水提取、分离工艺的新思路和新方法，并已实现产业化。随着酶法提取技术的不断完善，以及联用技术的出现，相关的问题也将得到有效解决，为中药提取开辟一条新的途径。
1 酶法在中药有效成分提取中的应用
1．1多糖类
在提取多糖的应用中，董氏等选用纤维素酶提取首乌藤多糖成分，有效地软化和溶胀细胞壁，从而改变细胞壁的通透性，在不破坏首乌藤多糖成分结构的同时使其快速浸出，且该工艺较为简单、耗能低、提取效率高，与传统水提醇沉法多糖得率(4．7％)和多糖含量(24．07％)相比，分别提高1．57％和6．96％。廉氏等采用超声波结合复合酶法提取沙枣多糖，因沙枣为果实类药材，沙枣中的果胶会造成提取液黏度增大，极大地影响有效成分的扩散。故在第一阶段通过纤维素酶和果胶酶联用，酶解细胞表面结构及胞间连接物，降低提取液的黏度，使溶于水的胞内多糖浸出率增加；第二阶段通过超声波空化效应对原料的破碎作用，加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于有效成分的溶出。2种工艺的结合不仅提高了提取效果，且二者联用还能弥补彼此间的不足。许氏等通过采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶法与热水浸提法提取竹节参中多糖成分的工艺比较研究，得出复合酶法提取效果较好，多糖得率为14．3％，与热水浸提法多糖成分得率11．61％相比明显提高。最佳工艺条件为料液比1：50，纤维素酶的质量分数1．2％，果胶酶的质量分数1．O％，pH值为5．O，温度为50℃，酶解时间2 h，90℃灭酶和浸提2 h。
1．2黄酮类化合物
许氏等在用酶法提取银杏总黄酮的研究中，由于银杏叶总黄酮在植物细胞中以苷元和苷的形式存在，故不宜以醇水体系提取，而利用转昔酶和糖等糖基供体将极性低的黄酮苷元、黄酮苷转为极性高的黄酮苷，提高了总黄酮在醇水中的提取率。利用Suhong475转苷酶强化银杏叶总黄酮提取的结果表明：温度在50～55℃，pH值为6．0～6．5，反应时间为10 h时，总黄酮的提取率比对照组增加44．0％。欧氏等在用酶法辅助提取绞股蓝中总黄酮工艺优化中，通过响应面法确定纤维素酶提取绞股蓝中总黄酮的最佳工艺条件为：酶解温度为49℃，pH值为3．9，酶解时间为2．5 h，酶用量为120 u／IllL，总黄酮得率为0．357％，与传统溶剂浸提法的总黄酮得率0．266％相比提高了25．0％。旷氏等经单因素试验和正交试验考察pH、酶解时间、酶解温度、酶的用量4个因素对水酶法与超声相结合提取连翘中总黄酮工艺的影响，结果显示：在纤维素酶的用量为1．2％、pH值为6．0、酶解温度为50℃的条件下酶解4 h，连翘总黄酮的提取率为10．54％。王氏等采用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶法提取苦瓜叶中的总黄酮，苦瓜叶总黄酮的提取率可达到3．13％，与直接醇提工艺相比总黄酮提取率提高了30．0％以上，提取工艺为：纤维素酶浓度为0．8 mg／ⅡlL，果胶酶浓度为0．5 mg／mL，提取温度为55℃，提取介质pH值为4．5的条件下酶解140 min。
1．3苷类化合物
郭氏等利用基因工程菌甲醇毕赤酵母生产的漆酶提取黄芪总皂苷，经正交试验优化后，发现漆酶提取的最佳工艺为：漆酶加入量1359 u／g(黄芪粗粉)，pH值为4．0，在40℃的温度下酶解1．5 h，之后补水至总体积为50 mL，最后在100℃温度下提取1．5 h。结果显示，经过漆酶酶处理后的提取率比未经酶处理的提取率提高65．6％。郑氏等采用二次通用旋转试验研究苦杏仁酶水解栀子苷制备栀子苷元的工艺，试验以pH值、反应温度、反应时间和酶加入量4个因素对工艺进行考察，在pH值为5．25、反应温度50．5℃、反应时间90 min、酶加入量1：10的条件下，采用理化性质及核磁共振波谱鉴定产物结构，高效液相色谱峰面积归一化法检测产物纯度。结果显示：产物栀子苷元得率>34．5％，质量分数为99．6％。樊氏等用酶解法与微波法相结合提取积雪草总苷，经正交试验表明，提取最佳工艺条件为：酶解温度45℃，液固比36，酶解时间30min，微波辐射1 10 s。在此条件下积雪草总苷得率为27．10％，分别是水煎煮、索氏提取的124％、183％。耗时分别为上述两方法的1／4、1／6。
1．4生物碱类
李氏等研究不同提取法在提取川乌过程中对生物碱的影响中发现，纤维素酶提取法具有明显的优势。纤维素酶法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0．002 447％、O．244 410％~半仿生提取法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为O．001 735％、0．189 340％：乙醇回流提取法：乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0．001 869％、O．200 720％。其最佳酶解提取工艺条件为：酶用量3 mg／g，温度为45℃，pH值为4．5，酶解时间为5 h。徐氏等用超声一酶法联合技术提取黄柏中小檗碱，与未经纤维素酶处理的对照组比较，具有提取效率高、省时、高效节能等优点。提取最佳工艺条件为：水浴时间2．5 h，超声功率80％，加酶量20 mg／g，水浴温度60℃。陈氏等“将白英药材经纤维素酶处理后用乙醇回流提取总生物碱，通过正交试验优化酶处理工艺参数。结果显示，温度50℃、酶反应时间3 h、pH值为4．5、酶质量浓度为1．6 mg／L的条件下酶法提取率为传统提取法的5倍。
1．5有机酸类
张氏等用酶法和超声波提取相结合的方法得到杜仲叶中绿原酸提取的最佳工艺条件为：溶剂pH值为5．O、酶解温度为40℃、料液比为1：lO、超声时间为30 min，在此条件下绿原酸提取率可达3．05％。酶法和超声波法结合提取，其绿原酸提取率比单一酶法高5．54％，比超声波提取高16．68％。张氏等通过研究纤维素酶提取车前草中熊果酸的工艺，得出最佳工艺条件：pH值为5．0、酶用量5．0mg／g、酶解温度60℃、酶解时间2．5 h。在此条件下车前草中熊果酸提取率达O．54％。
1．6油类物质
陈氏等对酶法和水蒸气蒸馏提取法提取没药中挥发油成分进行比较研究，结果显示：水蒸气蒸馏一萃取法提取没药挥发油1．1 g，产率为2．2％，占挥发油总量的69．75％；经纤维素酶处理提取挥发油2．1 g，产率为6．O％，占挥发油总量的70．05％。纤维素酶提取所得没药油收率比未经酶处理所得没药油收率提高大约3倍。刘氏等通过对酶法一亚临界水提取沙姜有效成分的研究表明，最佳工艺条件为在温度120℃、压力8 MPa、淀粉酶用量为0．3％、投料量100 g条件下提取20 min，与单纯亚临界水提法相比，精油的提取率提高了lO．0％以上。
1．7萜类化合物
马氏等研究以纤维素酶提取穿心莲内酯，在pH值为5．0、温度为40℃、水浴时间为1．5 h条件下对比加酶(加酶量10 u／g)与未加酶提取对穿心莲内酯提取率的影响，结果加酶法穿心莲内酯提取率为0．321％，未加酶法提取率为O．252％，酶法使穿心莲内酯的提取率提高了27．4％。喻氏等。”探索了纤维素酶辅助提取银杏叶萜内酯，结果经纤维素酶处理后用乙醇提取银杏叶萜内酯总提取率为0．40％，与单纯乙醇提取法相比银杏叶萜内酯的提取率提高了66．67％。
1_8其他成分
苗氏等在国内首次利用植物蛋白酶和糖化酶提取牛蒡中膳食纤维。在加酶量为植物蛋白酶6．O％、糖化酶1．2％、DH值7．0、温度50℃、酶解时间4 h条件下，牛蒡中膳食纤维提取率为63．74％。杨氏等采用1．0％纤维素酶、0．2％果胶酶、1％木聚糖酶，以水为溶剂(加水量为蜂花粉质量的2倍)，在pH值为5．O、温度为50℃、酶解6 h条件下提取蜂花粉中的活性蛋白。结果蜂花粉平均破壁率为94．5％，粗蛋白平均提取率为47．6％。郑氏等用纤维素酶提取老鹳草中的鞣质，结果在相同的工艺条件下，经纤维素酶处理后进行水提取比直接水提取鞣质的含量明显提高。刘氏等在探索中性蛋白酶酶解提取牡蛎牛磺酸工艺条件研究中发现最佳工艺条件为：在温度40℃、加酶量1000 u／g(鲜肉)、pH值为7．2、料液比l：9(g／L)条件下水解5 h，牛磺酸提取量为2．623 mg／g(鲜肉)。徐氏等在酶解法制备鹿茸多肽研究中，通过单因素试验和正交试验得出最佳酶解工艺条件：在温度48℃、加酶量6000 u／g、pH值为7．2、底物浓度为7．5％、胰蛋白酶与复合蛋白酶比1：9(g／L)条件下水解4 h，多肽得率为72．8％。
2酶法提取技术上存在的问题
酶法作为一种提取中药有效成分的新方法，无论在实践还是理论方面均未成熟和完善，存在以下问题：①酶是一类生物催化剂，其活性易受温度、pH值、酶浓度及酶解作用时间等因素影响，这些因素稍有变化，便会影响酶的活性。因此，需根据试验来选择合适工艺条件，严格控制这些因素，以发挥酶的最大作用。如纤维素酶法提取浒苔多糖时需要在加酶量为8．0％、温度40℃、pH值为5．O条件下进行，且提取时间为2．5 h 。而用复合酶提取褐藻糖胶时，加酶量为1．0％、温度30℃、pH值为3．5条件下进行，且提取时间为1．5 h 。②在酶法提取过程中，酶有可能与中药所含某些成分发生反应，产生新的化学物质；在酶的灭活方面也有可能存在残留酶，从而对产物的纯度、得率及制剂疗效、质量检测与控制、制剂的剂型等产生影响。③中药种类繁多，其细胞结构及有效成分不尽相同，需要根据实际情况选择酶的种类，尚无统一的参考标准。④目前酶解法提取中药有效成分的研究大多停留在实验室阶段，且多是针对单味中药的提取，与实际生产与应用还有一定的距离。
3展望
虽然酶解法技术尚不完善，但相对其他提取方法而言还是有许多优点，如可以提高产物提取率，保障产物的纯度、稳定性及活性，对中药成分影响小，缩短提取时间，降低耗能，操作和设备简单，成本低廉等。另外，国内一些学者把酶法与其他一些新的提取工艺如膜分离技术、超声提取技术、微波技术等相结合，取得了一定进展。如刘氏等用复合酶解一微波萃取、超滤相结合的新工艺提取及纯化灰树花多糖，并且对提取和纯化工艺进行了研究；姚氏等用酶法结合超声技术提取纯化菊米总黄酮，提高黄酮类化合物的提取率和含量；孙氏等。”以半仿生一酶法提取半夏白术天麻汤有效成分，体现出中药复方整体、综合、客观的特点；王氏以独创的水提工艺结合生物酶工程、絮凝技术、膜分离和大网格组合大孔吸附树脂技术提取三七总苷，提出了中药水提取、分离工艺的新思路和新方法，并已实现产业化。随着酶法提取技术的不断完善，以及联用技术的出现，相关的问题也将得到有效解决，为中药提取开辟一条新的途径。
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