转基因中药前期安全性评价技术探讨
核心提示： 基因转化已被证明是提高经济作物产量和改善品质的有效途径，并带来巨大经济效益。随着我国中药产业的不断发展，中医药正被世界上越来越多的人接受，这对中药材的产量和质量提出更高的要求。国家《中药材生产质量管理规
基因转化已被证明是提高经济作物产量和改善品质的有效途径，并带来巨大经济效益。随着我国中药产业的不断发展，中医药正被世界上越来越多的人接受，这对中药材的产量和质量提出更高的要求。国家《中药材生产质量管理规范》(GAP)的实施，推动传统栽培品种的良种选育，人工种植的新品种不断增多，已发展成为一类新型经济作物。但传统种植品种随着种植年限的增加，种质退化，病虫害发生率增加，新种植品种在离开野生环境与生长状态，大面积集中栽培条件下，抗病性下降、有效成分减少等问题突出。因而，应用生物技术改良中药品种、优化种质资源已逐渐成为中药材生产研究的重要方向之一。中药(植物)是防治疾病的药材，不仅存在转基因食品方面的安全问题，还存在药用价值是否改变的问题。将转基因技术应用于植物类中药中更要考虑外源基因的导人对药材品质的影响，如果插入外源基因导致药材某些化学成分、甚至药效成分改变，则丧失原有药用价值。受大多数中药品种有效成分和作用机理不明确的限制，药用植物转基因产物的药效评价问题是其中最突出最难解决的问题。鉴于此对转基因中药一直持谨慎态度，也使基因工程技术在中药中的应用“裹足不前”，因而对转基因中药的评价研究显得尤为重要。随着分子生物学、药理学、化学分析技术等的发展，基因组学、蛋白质组学、代谢组学等的分析技术可以在较高的整体水平上揭示外源基因对药材品质的影响，在实验室研究阶段，大田释放前就开展前期的评价研究，可从物质基础角度揭示转基因植株与非转基因亲本之间是否具有实质等同性，为进一步的毒理、药理和药效评价提供参考和依据。
一、药用植物基因工程研究概况
虽然药用植物的遗传转化研究起步相对较晚，但世界上对转基因药用植物的研究范围和深度正不断发展。目前国内外药用植物基因工程研究已涉及鱼腥草、巴戟天、广藿香、枳壳、颠茄、北玄参、蒲公英、薄荷、崧蓝、百合、枸杞、甘草及松果菊等10余种药用植物。此研究大多以提高抗病性或提高其药用成分含量为目的，如抗菌肽基因导人鱼腥草；半夏凝集素基因导人百合基因组中；诱根有关的ml基因导人蒲公英；几丁质酶基因导入西洋参植株；抗除草剂的草丁膦乙酰转移酶基因导人人参植株等；将4s一柠檬烯合成酶基因转化薄荷，提高植株单萜含量及薄荷酮的含量；转化单个限速酶天仙子胺6一B一羟基化酶基因，提高莨菪毛状根培养生产抗胆碱药东莨菪碱的产量等。目前对药用植物有效成分生物合成的基因调控研究进展迅速，已经克隆了抗肿瘤药物紫杉醇、长春新碱、长春花碱、抗菌药紫草宁、抗疟疾药青蒿素及镇痛药吗啡等次生代谢产物的生物合成相关酶的基因。随着对代谢途径中关键基因的阐明，应用基因工程技术可实现对代谢途径的调节，从而大大提高代谢物产量。
二、转基因中药的安全性
目前对中药基因工程的研究相对较少，研究基础仍然薄弱，缺乏系统性和深人性，特别是缺乏对转基因中药评价的系统研究，限制了基因工程技术在中药中的应用，转基因技术在中药产业中尚未带来巨大效益。
目前，认为转基因植物食品的安全性主要集中在两个方面，一是影响人体健康的食用安全性，二是影响生态环境的安全性。虽然国际上已基本确立转基因植物食品的安全性评价原则，并形成系列评 价方法，我国亦建立相应的法规和管理办法，但中 药作为特殊用途的植物有别于提供营养的食品，除了转基因食品存在的安全问题之外，还存在转基因对药材品质和有效性的影响问题。中药具有多成分协调、互补和制约的特点，与食品的风味和营养是相对固定的组成比例和浓度构成类同，在目前尚未形成针对转基因中药评价的独特体系情况下，可借鉴转基因食品(作物)的实质等同性评价原则。
实质等同性原则由经济合作与发展组织 (0ECD)于1993年首次提出，2000年再次被FAO／WH0确定为评价生物技术生产的作物和食品安全性的最适当的基本原则，根据该原则，若一种生物工程食物或食物成分与其相应的传统食物或食物成分基本相同，则可以认为具有相同的安全性[2]。实质等同性分析是一种动态过程，要在相同的环境、相同的生长状态下进行比较，既要对插人外源基因带来的特定差异(预期效应)进行评价，还要分析是否因产生明显的非预期效应而不具有实质等同性。这种基于比较的指导原则已被许多国家采纳为评估转基因食物安全性的起点。已有耐草甘膦大豆等50多种转基因作物相继通过以实质等同性原则为依据的安全性评价[3]。用作选择标记的卡那霉素抗性基因(npt-II)及编码的NPT-II蛋白已通过安全性评价。
植物遗传转化中非预期效应的产生机制在于DNA的随机插入，可能出现难以预期的几种结果，包括：外源DNA插入宿主基因的编码区内，“阅读框”被改变而不能表达有效的功能蛋白；插入在基因的调节区内，受其调控的内源基因不能有效表达；插入基因组的某个“敏感域”，导致原本“沉默”的内源基因被“激活”而高效表达；外源基因的转录或表达产物成为诱导或抑制内源基因表达的活性因子，直接或间接地使这些内源基因的表达发生质或量的改变。
三、评价技术及应用
由于大多数中药的有效成分和作用机理并不明确，因而针对有效成分、药效和安全性的评价受到限制，而转基因对基因组功能的影响是转基因产生非预期效应的基础。因而运用实质等同性概念，采用系列“组学”技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析技术能较全面分析转基因对中药植株的影响。组学分析在技术操作过程中具有无指向性、无偏见的特点，可为判断转基因对药用植物品质的影响及进一步的安全性评价提供重要信息。
1．基因组分析技术
转化的外源基因通过同源重组或非同源重组随机整合到受体染色体DNA上，整合位点是随机的，整合方式有多种，如单拷贝单位点整合、串联多联体单位点整合、单拷贝或多拷贝在多位点整合等。外源基因插入的位置和拷贝数的不同必将对宿主基因和外源基因的表达产生影响，使转基因后代质组分析技术研究4种转基因马铃薯品系中的外源基因的非预期效应。该研究以2-DE技术为基础，采用质谱分析技术和HPLC-ESI-MS技术，从转基因马铃薯中检测到50余种差异表达的蛋白质，又进一步将蛋白质组差异分析和免疫分析技术相结合，对转基因植物的致敏性进行分析。
4．代谢组学分析技术
基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，而药用植物的药效物质基础主要在于次生代谢产物。一种药用植物往往含有千百个化学成分，而一个化学成分又有多方面的药理作用，这些因素导致药物的作用机制十分复杂。代谢组学技术为转基因药用植物的实质等同性评价提供有力的技术支持，可以为药效学评价提供重要依据。
代谢组学是对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科。目前常用技术有色谱技术和光谱技术等。RoesnnerE21]利用GS／MS分析技术，对马铃薯块茎中150种化合物进行定性和定量分析，发现过度表达葡萄糖激酶基因、葡萄糖磷酸酶基因的转基因植株出现了差异。Le Gallt221利用1H-NMR分析技术，对转基因番茄及其非转基因亲本在不同成熟阶段进行代谢物轮廓谱分析，发现在红熟时期转基因番茄除了6种主要类黄酮苷的含量比非转基因番茄显著增加外，柠檬酸、果糖、苯丙氨酸等至少15种代谢物在含量上是有显著差异。近红外光谱(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)分析技术是20世纪80年代后期迅速发展起来的一项测试技术。芮玉奎等例以转基因油菜及其亲本为实验材料，借助近红外光谱仪对转基因油菜及其亲本中的芥酸和硫甙进行测定，发现转基因油菜中的芥酸含量明显高于亲本中的含量，芥酸含量是非转基因亲本1．5～2．0倍；硫甙含量也表现出与芥酸相同的规律，转基因油菜中显著高于其相应亲本，是亲本含量的1．3～1．5倍以上。焦哲等通过NIRS结合PLS回归分析方法发现转基因作物与对照样品在淀粉、蛋白质、脂肪、某些糖类、黄酮类物质的含量方面存在差别。
“代谢指纹图谱”可研究内源性代谢物的变化，直接反映体内生物化学过程和状态的变化。中药指纹图谱分析能较全面反映中药内在化学成分的种类、数量及其组成，进而反映中药的质量。因而通过指纹图谱并借鉴上述技术对比分析转基因与非转基因中药所含的各种成分的含量比例，是目前评价转基因对中药质量影响可采取的重要方法。
四、结 语
转基因中药与其他转基因作物的应用范围不同，在安全性评价方面既有共性，也有其特殊性，相关研究有待进一步深入。在尚未形成针对转基因中药评价的独特体系的情况下，可借鉴转基因食品(作物)的实质等同性评价原则，采用分子生物学技术，通过转基因植株的遗传特性和表型分析验证转基因的预期效应，应用系列组学分析，结合生物信息学等技术从基因组、蛋白质组、代谢组等进行多层次、多角度的分析，揭示外源基因的插入对基因组功能以至对药材质量的影响；从物质基础角度揭示转基因植株与非转基因亲本之间是否具有实质等同性，在较高的整体水平检查出产生的非预期效应，为中药植物代谢中发生变化的性质和范围提供详细的资料，获得具有一定预见性的前期评价结果，对进一步的药理学、毒理学评价有重要的指导意义。
一、药用植物基因工程研究概况
虽然药用植物的遗传转化研究起步相对较晚，但世界上对转基因药用植物的研究范围和深度正不断发展。目前国内外药用植物基因工程研究已涉及鱼腥草、巴戟天、广藿香、枳壳、颠茄、北玄参、蒲公英、薄荷、崧蓝、百合、枸杞、甘草及松果菊等10余种药用植物。此研究大多以提高抗病性或提高其药用成分含量为目的，如抗菌肽基因导人鱼腥草；半夏凝集素基因导人百合基因组中；诱根有关的ml基因导人蒲公英；几丁质酶基因导入西洋参植株；抗除草剂的草丁膦乙酰转移酶基因导人人参植株等；将4s一柠檬烯合成酶基因转化薄荷，提高植株单萜含量及薄荷酮的含量；转化单个限速酶天仙子胺6一B一羟基化酶基因，提高莨菪毛状根培养生产抗胆碱药东莨菪碱的产量等。目前对药用植物有效成分生物合成的基因调控研究进展迅速，已经克隆了抗肿瘤药物紫杉醇、长春新碱、长春花碱、抗菌药紫草宁、抗疟疾药青蒿素及镇痛药吗啡等次生代谢产物的生物合成相关酶的基因。随着对代谢途径中关键基因的阐明，应用基因工程技术可实现对代谢途径的调节，从而大大提高代谢物产量。
二、转基因中药的安全性
目前对中药基因工程的研究相对较少，研究基础仍然薄弱，缺乏系统性和深人性，特别是缺乏对转基因中药评价的系统研究，限制了基因工程技术在中药中的应用，转基因技术在中药产业中尚未带来巨大效益。
目前，认为转基因植物食品的安全性主要集中在两个方面，一是影响人体健康的食用安全性，二是影响生态环境的安全性。虽然国际上已基本确立转基因植物食品的安全性评价原则，并形成系列评 价方法，我国亦建立相应的法规和管理办法，但中 药作为特殊用途的植物有别于提供营养的食品，除了转基因食品存在的安全问题之外，还存在转基因对药材品质和有效性的影响问题。中药具有多成分协调、互补和制约的特点，与食品的风味和营养是相对固定的组成比例和浓度构成类同，在目前尚未形成针对转基因中药评价的独特体系情况下，可借鉴转基因食品(作物)的实质等同性评价原则。
实质等同性原则由经济合作与发展组织 (0ECD)于1993年首次提出，2000年再次被FAO／WH0确定为评价生物技术生产的作物和食品安全性的最适当的基本原则，根据该原则，若一种生物工程食物或食物成分与其相应的传统食物或食物成分基本相同，则可以认为具有相同的安全性[2]。实质等同性分析是一种动态过程，要在相同的环境、相同的生长状态下进行比较，既要对插人外源基因带来的特定差异(预期效应)进行评价，还要分析是否因产生明显的非预期效应而不具有实质等同性。这种基于比较的指导原则已被许多国家采纳为评估转基因食物安全性的起点。已有耐草甘膦大豆等50多种转基因作物相继通过以实质等同性原则为依据的安全性评价[3]。用作选择标记的卡那霉素抗性基因(npt-II)及编码的NPT-II蛋白已通过安全性评价。
植物遗传转化中非预期效应的产生机制在于DNA的随机插入，可能出现难以预期的几种结果，包括：外源DNA插入宿主基因的编码区内，“阅读框”被改变而不能表达有效的功能蛋白；插入在基因的调节区内，受其调控的内源基因不能有效表达；插入基因组的某个“敏感域”，导致原本“沉默”的内源基因被“激活”而高效表达；外源基因的转录或表达产物成为诱导或抑制内源基因表达的活性因子，直接或间接地使这些内源基因的表达发生质或量的改变。
三、评价技术及应用
由于大多数中药的有效成分和作用机理并不明确，因而针对有效成分、药效和安全性的评价受到限制，而转基因对基因组功能的影响是转基因产生非预期效应的基础。因而运用实质等同性概念，采用系列“组学”技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析技术能较全面分析转基因对中药植株的影响。组学分析在技术操作过程中具有无指向性、无偏见的特点，可为判断转基因对药用植物品质的影响及进一步的安全性评价提供重要信息。
1．基因组分析技术
转化的外源基因通过同源重组或非同源重组随机整合到受体染色体DNA上，整合位点是随机的，整合方式有多种，如单拷贝单位点整合、串联多联体单位点整合、单拷贝或多拷贝在多位点整合等。外源基因插入的位置和拷贝数的不同必将对宿主基因和外源基因的表达产生影响，使转基因后代质组分析技术研究4种转基因马铃薯品系中的外源基因的非预期效应。该研究以2-DE技术为基础，采用质谱分析技术和HPLC-ESI-MS技术，从转基因马铃薯中检测到50余种差异表达的蛋白质，又进一步将蛋白质组差异分析和免疫分析技术相结合，对转基因植物的致敏性进行分析。
4．代谢组学分析技术
基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，而药用植物的药效物质基础主要在于次生代谢产物。一种药用植物往往含有千百个化学成分，而一个化学成分又有多方面的药理作用，这些因素导致药物的作用机制十分复杂。代谢组学技术为转基因药用植物的实质等同性评价提供有力的技术支持，可以为药效学评价提供重要依据。
代谢组学是对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科。目前常用技术有色谱技术和光谱技术等。RoesnnerE21]利用GS／MS分析技术，对马铃薯块茎中150种化合物进行定性和定量分析，发现过度表达葡萄糖激酶基因、葡萄糖磷酸酶基因的转基因植株出现了差异。Le Gallt221利用1H-NMR分析技术，对转基因番茄及其非转基因亲本在不同成熟阶段进行代谢物轮廓谱分析，发现在红熟时期转基因番茄除了6种主要类黄酮苷的含量比非转基因番茄显著增加外，柠檬酸、果糖、苯丙氨酸等至少15种代谢物在含量上是有显著差异。近红外光谱(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)分析技术是20世纪80年代后期迅速发展起来的一项测试技术。芮玉奎等例以转基因油菜及其亲本为实验材料，借助近红外光谱仪对转基因油菜及其亲本中的芥酸和硫甙进行测定，发现转基因油菜中的芥酸含量明显高于亲本中的含量，芥酸含量是非转基因亲本1．5～2．0倍；硫甙含量也表现出与芥酸相同的规律，转基因油菜中显著高于其相应亲本，是亲本含量的1．3～1．5倍以上。焦哲等通过NIRS结合PLS回归分析方法发现转基因作物与对照样品在淀粉、蛋白质、脂肪、某些糖类、黄酮类物质的含量方面存在差别。
“代谢指纹图谱”可研究内源性代谢物的变化，直接反映体内生物化学过程和状态的变化。中药指纹图谱分析能较全面反映中药内在化学成分的种类、数量及其组成，进而反映中药的质量。因而通过指纹图谱并借鉴上述技术对比分析转基因与非转基因中药所含的各种成分的含量比例，是目前评价转基因对中药质量影响可采取的重要方法。
四、结 语
转基因中药与其他转基因作物的应用范围不同，在安全性评价方面既有共性，也有其特殊性，相关研究有待进一步深入。在尚未形成针对转基因中药评价的独特体系的情况下，可借鉴转基因食品(作物)的实质等同性评价原则，采用分子生物学技术，通过转基因植株的遗传特性和表型分析验证转基因的预期效应，应用系列组学分析，结合生物信息学等技术从基因组、蛋白质组、代谢组等进行多层次、多角度的分析，揭示外源基因的插入对基因组功能以至对药材质量的影响；从物质基础角度揭示转基因植株与非转基因亲本之间是否具有实质等同性，在较高的整体水平检查出产生的非预期效应，为中药植物代谢中发生变化的性质和范围提供详细的资料，获得具有一定预见性的前期评价结果，对进一步的药理学、毒理学评价有重要的指导意义。
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