中药生物技术与中药资源的可持续发展
胡之璧，l934年生，安徽潜山人。上海中医药大学中药研究所研究员、博士生导师，中国工程院院士，是我国中药生物工程研究创始人之一。1956年毕业于华东药学院(现中国药科大学)，1959年获硕士学位，1984年获德国图平根大学理学博士。1985年到上海中医药大学创建中药生物工程研究室，主要从事中药生物技术研究。应用现代植物基因工程和细胞工程高新技术，开展了洋地黄细胞培养与强心苷生物转化研究，培育出国际上转化得率最高的
洋地黄细胞株，即著名的“胡氏细胞株”；率先将农杆菌Ri质粒成功地引入40余种中草药基因组中，使其生长速度和有效成分含量大大超过天然药材；利用转内源双基因和转外源基因技术获得了黄芪甲苷含量比黄芪道地药材提高十几倍的黄芪毛状根，为开创中药生产与研究的新局面做出了杰出贡献。历任上海中医药大学中药研究所所长，
国家中医药管理局中药生物工程重点研究室主任和上海市教育委员会中药学重点学科带头人；1994年当选中国工程院院士。先后发表学术论文160多篇；参编《中华人民共和国药典》《药材学》《中国植物志》《中药志》等权威性著作，主编了国家“十一五”研究生规划教材《中药现代生物技术》；多次荣获国家科技进步二等奖及上海市科技进步一等奖，2001年获香港求是科技基金会“中医药现代化杰出科技成就奖”，2009年被授予第三届中国中医科学院唐氏中药发展奖；为全国侨界优秀教师、上海市劳动模范、全国“五一”劳动奖章获得者，全国三八红旗手，上海中医药大学教学名师。
中药在我国应用有悠久的历史。近年来，随着中药产业的发展，中药资源领域暴露出的问题日益突出，如药材品质下降、野生药材数量锐减等。因此，大力开展中药资源研究，对于保护现有资源、寻找和开发新资源等以达到可持续利用的目的，具有非常重要的意义。
1 中药生物技术在中药资源可持续发展中的应用
根据普查资料，我们国家共有12 807种中药材，其中动物药有l 581种，矿物药80种，植物药占了绝大多数，有11 146种。常用的中药有400～500 种，其中80％来自野生资源，由于需求日渐增加，平均每年都会有20％的药材短缺。近几十年来，生物技术在许多领域取得了巨大的进展，已渗透到中药的各个研究领域，在中药资源可持续发展、中药品种的鉴定和质量控制及中药作用机制和创新药物中的应用愈来愈广泛。目前，生物技术在促进中药资源的可持续发展方面主要有以下手段：如室内植物的大规模培养、代谢产物的细胞工程、遗传转化器官的扩增、生物转化系统的选择、代谢途径的基因工程、转基因生物的构建等¨[1-6]。
1．1 室内植物的大规模培养根据植物细胞具有全能性理论，利用植物离体的器官，如根、茎、叶、茎尖、花、果实等或组织、细胞，在适宜的人工条件下，可以再生出不定芽、不定根，最后形成完整的植株二这是植物组织培养的基本思路。与传统栽培技术相比，室内植物的大规模培养优点主要表现为：①占用空间小，不受地区、季节限制；②培养周期短，扩增速度快；⑧培养出的材料质量均一、可控、无病毒污染等等。这些对提高药材质量和产量都非常有益。1= 1．2代谢产物的细胞工程 应用大规模培养的植物细胞直接提取制备有用的化合物，是这一技术的基本思路。植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在，已经取得令人瞩目的成就。粗榧碱(Cepha—lotaxine)以及它的同系化合物harringtonine、deoxy—harringtonine、homoharringtonine、isoharringtonine是最早应用细胞工程获取的天然产物。当前，应用植物细胞的体外培养技术进行工业化或半工业化生产的代谢产物有不少报道。如日本Mitsui石油化学公司用黄连细胞培养生产的小檗碱，他们的细胞培养体系已经到达400 L规模；紫草细胞生产的紫草宁，也已经达到750 L规模。同样是日本的Nitto Denk0公司，用人参细胞和不定根培养生产的人参皂苷已达到20 000 L规模。
我们国家紫杉醇的细胞工程也取得了阶段性成果，但遗憾的是到目前为止，我们还没有进行工业化生产的实例。
植物细胞培养技术生产代谢产物具有以下优点：①所获得的产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；②可以在生物反应器中进行大规模培养，并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物；③所获得的产物可从培养体系内直接提取，可以快速、高效地提取制备，简化了分离与纯化程序；④有利于合成新的有效成分；⑤有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；⑥可以节省药材栽培土地，减少对农田的占用。[1，2,4]。
当然，代谢物的细胞工程方面也存在一些不足之处。例如：在植物细胞培养过程中普遍存在的细胞生长速度慢、遗传稳定性差、细胞系不稳定、不耐剪切力等等。生产成本问题，也成为实现规模化生产的一个瓶颈。这种情况下，细胞系的筛选、培养技术的改进、培养方法的更新、适合于植物细胞培养的生物反应器的研制都是解决这些问题的根本途径[3]。
再比如长春花生物碱合成：临床上用的抗肿瘤活性的药用成分为长春花碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)，研究发现这两种生物碱的合成需要不同类型的细胞参与，也就是说单纯培养的一种长春花细胞不能够合成长春花碱和长春新碱。因此，也就限制了通过细胞工程来生产这两种重要化合物。
1．3遗传转化器官的扩增对植物细胞进行遗传转化，可以获得畸形芽或者毛状根。这里，我们主要讨论一下毛状根。
毛状根是由整体植株或某一器官、组织、单个细胞等受到发根农杆菌的感染所产生的一种现象。通过一定机制，农杆菌的将它的一段T—DNA序列整合到宿主植物细胞基因组中，由此随着宿主植物细胞而遗传。主要表现就是在感染部位形成像毛发一样的根状组织，也就是毛状根，或者叫做发状根[7]。
要获得成功遗传转化，需要具备以下三个条件或步骤：①农杆菌要能识别宿主细胞；②农杆菌吸附并侵入宿主细胞；③农杆菌的T—DNA整合到宿主的核染色体上。
毛状根与植物细胞相比，具有遗传特性较为稳定、生长速度快、代谢产物含量高等优点，因此也是生产中药药用资源的有效手段[7-8]。
表1所示为几种不同材料合成丹参酮类化合物的比较情况。可以看出，丹参原植物生长3～4年，总丹参酮含量为0．092％，其中原丹参酮为0．051％；培养的丹参细胞生长4周，总丹参酮和原丹参酮含量明显提高；培养的不定根生长8周，总丹参酮和原丹参酮含量可以达到2．670％和l．215％；而丹参毛状根生长3周，总丹参酮和原丹参酮含量是不定根的1．6倍以上。9]。通过这个对比可以看出，在某些代谢产物合成方面，毛状根具有明显的优势。
表1 不同材料合成丹参酮类化合物的比较
培养材料 生长时间 总丹参酮含量(％) 原丹参酮含量(％)
丹参根 3～4年 o．092 0．051
丹参细胞 4周 1．250 1．372
丹参不定根 8周 2．670 1．215
丹参毛状根 3周 4．298 2．001
1．4生物转化系统的选择生物体内存在多种多样的酶，可以进行氧化、酯化、甲基化、糖基化、羟基化、乙酰化等等。在理论上，利用生物体系可以在温和的培养条件下，实现多种结构复杂的化合物的结构改造，由此可以扩大自然界天然产物来源，也就是扩大药用资源的来源。
通常采用的生物转化体系有以下几种类型：①悬浮细胞进行的生物转化反应；②固定化细胞进行的生物转化反应；③物酶制剂进行的生物转化反应。
植物悬浮培养细胞进行的生物转化反应，即在悬浮培养的细胞体系中加人适当的化合物来转化合成目的有效成分，同时还可以通过改变培养条件等
来提高有效成分含量以达到工业化的要求。例如，大戟科植物(Euphobia characias)悬浮细胞，添加牛儿醇转化得到橙花醇，产量可达lo m9·L～·2h～；毛地黄悬浮细胞，将l3一甲基毛地黄毒苷转化为甲基地高辛，产量达到800 mg·L·20d；紫苏的悬浮细胞可以吧伞形酮糖苷化为伞形酮．8一葡萄糖苷，产量为1 600 mg·L-1·d-1，等等。
固定化的培养细胞同样可以进行生物转化反应，例如固定化的洋地黄细胞对B-甲基毛地黄毒苷的转化为B一甲基地高辛，产量为9 mg·L-1·d-1。
培养的植物细胞对化合物的转化实际上是细胞中存在的某些酶参与催化的生物化学反应。因此，直接应用植物酶制剂也可实现高效的生物转化。
1．5代谢途径基因工程顾名思义，代谢途径基因工程就是在代谢途径上进行基因操作以达到人们预期目标的工程手段，这些预期目标可以是生产有用的化合物，也可以是阻断不需要(如毒性)成分的合成等等Ⅲ]。
代谢途径基因工程首先要了解各种化合物在生物合成途径过程中的关系，也就是对代谢途径要有较为清晰的认识。比如，尼古丁和托烷的生物合成路线、类异戊二烯生物合成途径等等，都是研究得较为深入的一些生物合成途径。
在此基础上通过基因工程，促进关键酶的过量表达，可以实现目标化合物的大幅度提高。比如，我们通过转多糖合成相关关键酶基因毛状根及转vgb 基因黄芪毛状根黄芪甲苷含量较非转基因黄芪毛状根提高6倍，较黄芪药材提高ll～12倍；而且转基因黄芪毛状根的生长周期仅为2～3周，远远低于药材生长所需的3年[7-8]。
1．6转基因生物的构建转基因生物的构建是指用基因工程技术在基因水平对生物体遗传特性进行改造的过程，因此，转基因生物也称为遗传改良生物，包括转基因微生物、转基因植物、转基因动物等。利用转基因生物体，人们可以获得药用植物中的药用活性物质，也可以获得药材中的蛋白和多肽活性成分等。现今，已经有不少从转基因植物中提取并开发为临床用药的报道。
2 中药生物技术在中药质量控制过程中的应用
中药材品质严重影响着中药的临床疗效。因此，药材的真伪和道地性鉴定是中药质量控制过程的重要一环[11]。
除矿物药外，大多数中药材所依赖的生物资源的多样性是基于其基因的多态性结果，而基因多态性可在分子水平上检测，它是比在形态、组织、化学水平上的检测更能代表其变异类型的遗传标记。根据技术原理的不同，中药鉴别的分子生物学方法主要有两大类：DNA分子标记技术和基因芯片技术。
DNA分子遗传标记技术是一种根据不同生物个体遗传物质DNA的差异来鉴别生物物种的方法。生物的外观性状、细胞形态、组织结构、化学成分、蛋白质等不仅受遗传因素的影响，还与生物的生长环境、发育阶段、生理状态有关；而DNA作为遗传信息的直接载体，不受上述因素的影响，因此DNA分子遗传标记鉴别药材的方法具有高度的准确性与可靠性。
DNA分子标记技术有以下几种：①限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)；②随机扩增多态性(RAPD)和任意引物PCR(AP—PCR)技术；③PCR扩增的特定片段的限制性位点分析(PCR—RFLP)；④DNA测序技术；⑤位点特异性鉴别PCR技术等。这些方法在具体操作上虽有不同，但都是在基因组水平进行核酸序列差异的对比分析。
基因芯片技术基于杂交的原理进行。首先要获得不同药材特异性基因序列，把这些特定序列作为探针固定于玻片上制成基因芯片。当一个来自植物或动物的中药样本中含有与之互补的特定基因片段时，基因芯片可将其测试出来，由单片芯片就可用于多种中药样品鉴别。这个技术优点是能对微量样本中的核酸序列信息进行快速、高通量和低成本检测、分析；缺点是需要首先能获取不同的中药样本的特异性基因序列。但是，由于对中药基因组及其特征DNA序列知之尚少，芯片技术的应用受到一定限制。
在中药材中进行分子生物技术鉴别方法与传统中药鉴别方法相互结合，发挥各自优势，可以更好地完善中药质量评价体系，发展现代中药质量控制技术，为中药现代化安全、有效、可控的关键[11]。
3现代生物技术在中药作用机制和创新药物中的应用
现代生物技术在中药作用机制和创新药物中的应用主要包括以下几方面：基因芯片在中药作用机制研究中的应用、基因芯片在中药毒理研究中的应用、基因芯片在中药新药筛选中的应用、转基因动物在中药新药筛选中的应用。
基因芯片用在中药作用机制研究中，可以快速确定几百个潜在的新型药物靶体，对成千上万的基因在不同细胞部位的表达进行跟踪监测，为研究中药在分子水平的作用机制提供强大的科学依据。国内外已有很多报道，其中包括单体、单味中药和复方等等。
同样，基因芯片也可以用于阐明中药毒理机制。把药物的毒性与基因表达特征联系起来，从而在分子细胞水平上准确、快速、高效地评价中药复方及其组成药物是否有毒提供有效的评价手段。
我们知道，新药研制的一般过程是根据疾病的发病机制，确定药物作用的靶点，建立相应的新药筛选模型，再通过筛选不同来源的化合物发现先导化合物，然后将其开发成新药。基因芯片用在新药筛选过程中则是利用了这样一个基本原理：药物都是直接或间接地通过修饰、改变和影响生物体的基因表达或表达产物的功能而产生疗效。那么，反之，应用芯片技术，通过检测不同药物成分作用于细胞后基因表达的变化，就可以迅速找到有效成分，从而更快速、更准确地进行药与药的配伍、成分与成分的配伍，缩短新药研究的周期。
转基因动物是指用实验方法将外源基因导入其染色体基因组内进行稳定整合，并能遗传给后代的一类动物，它能够“真实”地体现目的基因的活动特征，将分子水平、细胞水平、整体水平的研究有机地联系起来，能够在不破坏活体原有系统的前提下，对～个或多个因素进行研究。转基因动物的优点是针对性强，可以大大缩短试验时间。因此，已成为人们进行药物“快速筛选”的一种手段。
总之，生物技术的发展为传统中药的生产和研究提供了良好的机会和方法。应用生物技术不仅可以保存和繁殖濒危的野生资源，大量生产高质量的常用药材和活性成分，还可以阐明中药及其复方的作用机制和毒理，为创新药物的筛选和研制提供基础。因此，中药生物技术研究和应用将会促进我国中药现代化的进程。我们也非常欢迎有志于这方面研究的青年学者加入我们的队伍。
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