均匀设计优选胆舒平胶囊的提取工艺研究

    胆囊炎系由感染、胆汁刺激、胰液向胆道反流，以及类脂质代谢失调等所引起的胆囊炎性疾病，是临床常见病、多发病。胆舒平胶囊(由陕西省渭南市中心医院制剂室提供)主要由虎杖、郁金、延胡索、川楝子等组成，具有清肝利胆、调气止痛的功效。主要用于急、慢性胆囊炎引起的右胁下作痛及压痛，经常向右肩背放射，恶心欲吐等症状。其中虎杖中的蒽醌类、郁金中的姜黄素、延胡索中的生物碱类[31、川楝子中的川楝素等有效成分均在乙醇中具有较好的溶解性，因此本文采用均匀设计法进行提取工艺研究，以为胆舒平胶囊的制备提供参考依据。

1仪器与试药

1．1仪器紫外分光光度计(岛津uv一2500)；Agilent ll00高效液相色谱仪(美国)；Sartorius 211D电子分析天平；DHG型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1．2试药 l，8一二羟基蒽醌对照品(批号：110829—9702)，延胡索乙素对照品(批号：110726—200409)均购自中国药品生物制品检定所。试剂：乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂为分析纯。

2方法与结果

2．1评价指标的选择

2．1．1 干膏得率的测定精密吸取各浓缩液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法(《中国药典>>2010年版)测定，计算干膏得率。

2．1．2总蒽醌提取量的测定啊(1)对照品溶液的配制：精密称取P₂O₅，干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌对照品ll．80 mg，置100mL容量瓶中，加80mL甲醇超声处理20min，使溶解，取出放冷，加甲醇至刻度，制成每毫升含l，8-二羟基蒽醌0．118 mg的溶液，即得。(2)供试品溶液的制备：精密吸取各浓缩液10mL，置具塞三角瓶中，加入20％的盐酸一乙醇溶液30 mL，超声处理5 min，水浴回流提取1 h，冰水冷却，置分液漏斗中，加入乙醚萃取3次，每次40 mL，合并乙醚液，蒸馏水洗至中性，回收乙醚至干，残渣；btl0．5％醋酸镁甲醇溶液使溶解，转移至100ml量瓶中，加0．5％醋酸镁甲醇溶液至刻度，摇匀，即得。(3)标准曲线的制备与方法学考察：精密吸取l，8-二羟基蒽醌对照品溶液0、1．0、2．0、3．0、4 0 5．0 mL，置25 mL容量瓶中，分别加入0．5％醋酸镁甲醇溶液至刻度，摇匀，在510 nm处测定吸收度。以浓度(c)为横坐标，吸收度似)为纵坐标，绘制标准曲线，经数据处理，得回归方程为A=47．518C+0．1105，r=0．9990。结果表明，1,8-二羟基蒽醌在4．72—23．6 μg／mL浓度范围内线性关系良好。在此系统条件下1，8-二羟基蒽醌精密度良好，RSD％=1．39％(n=5)；供试品溶液在90 min内基本稳定，RSD%=1．79％(n=5)；平均加样回收率分别为98．53％，RSD％=1．42％(n=6)。

2．1．3延胡索乙素提取量的测定 (1)对照品溶液的制备：精密称取延胡索乙素对照品5．02 mg，置l00 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每l mL含延胡索乙素50．2μg的对照品溶液，即得。(2)供试品溶液的制备：精密取各浓缩液5 mL，置50 m1一量瓶中，加甲醇45 mL，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。(3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：Kromasil Cl8(4．6 LLmx250 mm，5 μm)；流动相；乙腈一0．1％磷酸溶液(25：75)；检测波长为280 nm。结果表明：延胡索乙素在190—950 ng范围内线性关系良好，回归方程为：Y=32．28X一0．27，r=0．9995。精密度试验结果显示，RSD％=1．16％(n=5)，说明该法精密度良好；供试品溶液在8 h内基本稳定，RSD％=1．85％(n=5)；平均加样回收率分别为98．57％，RSD％=1．O7％(n=6)。(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各l0 mL，注入液相色谱仪，测定，并计算提取量。

2．2均匀设计法优选水提取工艺研究

2．2．1 因素水平根据方中各味药材所含有效成分的理化性质，选取乙醇浓度(X1)，乙醇用量(x2)，提取时间(X3)，提取次数(x4)作为考察因素，根据实际情况，乙醇浓度取12水平，乙醇用量取6个水平，提取时间取4个水平，提取次数取3个水平，试验中采用混合水平均匀设计表U12(12x6x4x3)安排实验。以总蒽醌提取量(权重系数0．4)、延胡索乙素提取量(权重系数O．4)和干膏得率(权重系数0．2)进行加权评分，作为综合评价指标，筛选最佳工艺条件。根据u12(12x6d4x3)的试验安排，按处方比例称取处方量的药材l82 g每份，照各实验设计方法进行提取，过滤，合并滤液，浓缩并定容至200 mL，备用。照“2．1”项下方法分别测定总葸醌、延胡索乙素的提取量和干膏得率。因素水平见表l，试验安排和结果见表2。

 表一 因素与水平

一

    表2 混合水平均匀设计试验安排表U₁₂(12×6×4×3)及结果

      注：综合评分=(总蒽醌提取量/总蒽醌提取量max)×0.4×100+(延胡索乙素提取重／廷胡索乙素提取量max) ×0.2×100。

2．2．3数据处理运用DPS6．55程序对试验结果进行二次多项式逐步回归分析，综合评分回归方程为：Y=-14.20+3.60X1—0．03X1X1+5．22X4X4+0．02X1X2-0．15X1X4-0．65X2X4，相关系数r=-0．9603，S=1．73，F=22.71。上述方程经隘验具有统计学意义(e=-0．0018<0．01)，方程成立。由综合得分回归方程可知，胆舒平胶囊的最佳提取工艺为：3hA8倍量53．3％的乙醇，提取3次，每次0．52h(合计31．2 min)。将以上各值代入方程，得到y=104．68，它优于表2中任一试验，但这只是理论推断结果，有待做进一步试验对其进行验证。根据实际生产情况，可将提取工艺定为加入8倍量53％的乙醇，回流提取3次，每次0．5 h.

2．2．4验证试验根据所求得的最优工艺条件进行验证实验，按处方量取l82 g药材，；bnA8倍量53％的乙醇，回流提取3次，每次0．5 h。滤过，滤液合并，浓缩，定容至_200 mL．测定其中总蒽醌、延胡索乙素的量和干膏得率.  （见表3）

表3 验证试验结果（n=3）

RSD(％)          2．82             0．79           0．11           1.34

    由试验结果可知，3次验证试验的Y=112．04(RSD％=1．34％)，优于表2中各试验，说明该提取工艺比较稳定可靠，重复性好。

3小 结

    均匀设计是目前中药提取工艺优选、处方筛选、药理药效筛选等研究中的常用试验设计方法之一，它可以将试验有关因素的各水平数均匀分散在实验范围内，使每一个试验点都有更好的代表性，减少了实验次数，非常适合中药处方筛选、提取工艺优化中经常涉及多因素、多水平的试验。本实验根据实际情况和中药材提取的一般规律，选取乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数等4个考察因素，采用混合水平均匀设计表U₁₂(l2x6x4x3)进行优化筛选工艺。

本处方中虎杖含有的蒽醌类成分、郁金中含的姜黄素、延胡索中含有的生物碱类成分、川楝子以川楝素等，是胆舒平胶囊促进胆汁分泌，加强胆囊收缩，促进胆囊排空，减轻疼痛的主要有效成分。实验中采用以总蒽醌提取量、延胡索乙素提取量和干膏得率等多种指标进行加权综合评分，对提取工艺进行综合评价，优选最佳的胆舒平胶囊提取工艺，避免了单一因素作为工艺评价带来的的局限性。通过对均匀设计法对优选的提取工艺进行验证，结果显示，3次验证的实验结果平均值与预测值非常相近，说明拟定提取工艺稳定可靠，重复性好，从而为胆舒平胶囊的制备提供了可靠依据。