蛋白质组学技术在中药作用机理研究中的应用

　　随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，人们清楚地认识到，研究蛋白质的结构与功能对阐明生命的本质及疾病的发生机制尤其重要。近十余年来，蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿，其研究技术已被应用于生命科学的众多领域。蛋白质组学从整体水平对蛋白质的研究与中医药学的基本内涵有着异曲同工之妙，能为中医药的研究和发展提供良好的理论依据和技术支持。

　　1“蛋白质组学”的提出及其意义

　　“蛋白质组”的概念于1994年提出，最初定义为一个基因组所编码的全部蛋白质。“蛋白质组学”是以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究细胞内全部蛋白质的组成、结构及其代谢规律的一门学科。过去认为，蛋白的表达可通过mRNA水平反映出来，然而有报道指出，细胞中水平与相应的蛋白质水平并不严格一致，仅通过mRNA水平不足以准确推测蛋白质的水平。蛋白质组学则可从分子水平阐明蛋白质的相互作用及蛋白质的作用机制等问题，有利于弄清疾病发生发展以及药物治疗的分子机制。

　　2蛋白质组学研究的主要技术

　　2．1双向凝胶电泳(tw0—dimensional gel electmphoresis，2一DE)2-DE技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的技术，已成为蛋白质组研究的重要工具。通过第一向等点聚焦电泳及第2．向SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，可获得样品的蛋白质组图谱。

　　2．2质谱分析(mass spectmmetry，MS)  将分离出来的蛋白酶切后，可用MS技术鉴定，其中，基质辅助激光解析，离子化一飞行时间质谱(MALDl—TOF—Ms)特别适合于混合蛋白多肽类物质的相对分子量测定，是目前蛋白质组学研究中的必备工具。Ms技术还包括连续流快原子轰击质谱(cf-FAB)、电雾离子化质谱(ESI)、傅立叶转换离子回旋共振质谱(FTICR—MS)等。

　　2．3二维色谱与质谱联用技术包括离子交换色谱一反相液相色谱、亲和色谱一反相液相色谱和色谱聚焦一反相液相色谱与MS联用。该技术可以弥补2-DE-Ms联用技术的某些缺陷，如低丰度蛋白、疏水性蛋白、极碱性蛋白及极端分子量蛋白不易被分离与鉴定、自动化程度低等。

　　2．4生物信息学  面对大规模的蛋白质序列信息和结构数据，蛋白质组学研究的种种技术都离不开生物信息学技术对生物信息的储存、检索、蛋白质序列比对、结构与功能的预测等。

　　3蛋白质组学技术在中药作用机理研究中的应用

　　3．1中药单体研究随着中药成分研究的深入，许多中药的有效成分已经被确定、分离或人工合成，研究者们运用蛋白质组学技术对一些中药的有效单体进行分子作用机理研究。王鹂等观察了中药蟾酥中的甾类化合物华蟾毒精对癌细胞增殖的作用，结果表明，华蟾毒精对人宫颈癌细胞的增殖有显著抑制作用，根据初步的蛋白质2-DE结果，华蟾毒精作用后，人宫颈癌细胞中小分子量酸性蛋白发生了较大变化：相对分子质量15000—25000的蛋白质点分布形状显著改变，出现了一些新的点；而相对分子质量25000—55000的区域，部分蛋白质点灰度明显增加，提示该范围蛋白质表达量有所增加。由此推测，华蟾毒精可能对微管蛋白产生影响，从而导致细胞有丝分裂发生变化，进而影响细胞的增殖。郭平等从整体蛋白质的水平上探讨芍药苷对人骨髓成纤维样基质细胞系(HFCL)蛋白质表达的影响，2-DE分离及质谱鉴定结果显示，芍药苷能使HFCL蛋白质中的9种表达上调，5种下调。上调的蛋白质有Ras相关核蛋白、核纤层蛋白、异柠檬酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、AllP合酶、核蛋白体蛋白质P2和CCT等；下调的蛋白质有人类cc趋化因子和Bax等。结果表明芍药苷能作用于骨髓基质细胞多种蛋白质靶点，促进细胞结构蛋白质的合成和蛋白质分子伴侣的表达，促进骨髓基质细胞的能量代谢，抑制其凋亡，间接发挥补血作用。安宁等利用固相pH梯度2一DE分离人参皂苷R9，处理前后人肺巨细胞癌高转移细胞株95D的总蛋白，对l5个差异表达的蛋白质点通过MALDl—TOF—MS／MS，液相色谱一电喷雾质谱联用法和蛋白质数据库检索进行鉴定，发现氯离子通道蛋白1、泛素结合酶E2—25 Kda等只在对照组有表达；14—3—30蛋白、Ski作用蛋白只在有表达。在R93组中，14—3—3蛋白、真核翻译起始因子4H的表达量显著高于对照组；膜联蛋白A2、肌动蛋白结合蛋白Ⅱ同构体b等蛋白的表达量显著低于对照组。结果提示R93处理前后人肺巨细胞癌高转移细胞株蛋白质组的表达存在明显差异，鉴定的差异蛋白质多与肿瘤的侵袭转移相关，可能为进一步发现与肺癌转移相关的分子标志物及阐明人参皂苷R93抗肺癌侵袭转移的分子作用机制提供线索。赵欣等研究松果菊苷对小鼠帕金森病模型黑质纹状体组织蛋白表达的变化，经2-DE分析，对照组、模型组和松果菊苷组小鼠黑质纹状体组织分别分离出282个、269个和236个蛋白质斑点；比较分析3组间的蛋白表达图谱，对一个稳定差异表达的斑点进行MALDI TOF—MS鉴定，数据库检索结果为胆绿素还原酶B。结果提示松果菊苷对小鼠帕金森病模型的行为学障碍有改善作用，其神经保护作用机制可能与胆绿素还原酶8水平降低有关。

　　3．2单味中药研究中药的化学成分非常复杂，而其进入人体发挥作用也是多组分、多靶点治疗。以往大多是采用单成分或单靶点的模式研究中药的物质基础与作用机理，并不适合中药作用的特点，利用蛋白质组学技术则可能更清晰全面地阐明中药的分子作用机制。谢文光等用2-DE技术研究了赤芍对大鼠热毒血瘀证的血清蛋白质组的影响，发现脂多糖(LPS)致热毒血瘀证大鼠血清在2-DE胶上13个蛋白点(xPr)／出现非常明显的含量变化；赤芍干预后，LPS引起增高的xPrl、xPr2、xPr3、xPr4、xPr9点容量值均显著降低；LPSiJl起降低的xPrl6点容量值显著增高，但仍显著低于正常组 xPrl、xPr4、xPr9点容量值均显著高于正常组；xPr2、xPr3两个蛋白点容量已被调节到正常状态。此结果提示，调节这6个蛋白点的表达可能是赤芍治疗热毒血瘀证的分子基础。梁恒等嗵过小鼠肾组织蛋白的双向电泳，发现山茱萸醇提物(FCE)给药后，IsA肾病小鼠肾组织差异蛋白质表达谱发生显著变化。IgA肾病和正常小鼠肾组织的2一DE图中，表达丰度差异在2倍以上的匹配蛋白点有263个；另有3种蛋白在IgA。肾病肾组织中未被表达，1种蛋白特异表达。比较FCE服用前后IgA肾病肾组织的2-DE图发现，用药后，原先差异表达的263个蛋白质中有147个显著地恢复正常表达；IrA肾病3种未表达和1种特异表达的蛋白都恢复了正常表达，同时用药后新出现1种特异表达蛋白。表明这些差异和特异表达的蛋白质可能是IgA肾病和FCE药物作用的靶蛋白，FCE能有效地纠正小鼠IgA肾病可能是通过影响这些靶蛋白而起作用的。魏小勇等用2一DE技术对正常和白内障大鼠晶状体总蛋白及糖基化蛋白进行了比较，探讨金钗石斛生物碱治疗糖性白内障的分子机制。结果显示金钗石斛生物碱具有较好的抗糖性白内障作用，除了能显著升高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及T—SOD活性、降低MDA活性外，还能逆转白内障晶状体中表达上调或下调的蛋白质，大部分糖蛋白的表达水平也有相应的变化，提示金钗石斛生物碱对晶状体蛋白质发生了作用，但具体作用机制尚有待进一步探讨。

　　3．3  中药复方研究  中药复方是由若干单味药按照严格的配伍规律组合而成的，其涉及的分子、细胞、器官是多层面的。目前，蛋白质组学方法是研究这种复杂的作用环节，进而揭示中药复方的作用靶点和机制的理想选择。吴伟康等利用双向电泳分离左心室肌总蛋白，比较正常组、缺血模型组及缺血+四逆汤组间蛋白的表达量，发现缺血+四逆汤组与单纯缺血模型组相比，表达显著上调的蛋白质有6个，下调的有7个。然后利用MALDl—TOF—MS确定各差异蛋白的种类，通过生物信息学分析所得蛋白的功能，结果表明四逆汤通过调节缺血心肌的能量代谢、信号转导、机能、心肌细胞修复和抗氧自由基损伤等多组相关蛋白的表达，对缺血心肌产生保护作用。王海彬等对绝经后骨质疏松症和中药作用机理进行了研究，2-DE分离骨组织蛋白质样品，用软件分析各组间差异蛋白质点，MALDl—TOF—MS分析，结合蛋白质生物信息库，初步鉴定了3个差异蛋白，分别为硫氧还蛋白过氧化酶l、阻凝蛋白轻链肽2和泛素化酶E2—17KD。初步认为这三种蛋白质在绝经后骨质疏松症的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用，其中前两种蛋白质是首次报道与骨质疏松发病相关，为揭示绝经后骨质疏松症的发病机理和中药的治疗机理提供了全新的实验证据。叶能胜等采用双龙方含药血清对中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为心肌样细胞的过程进行人工干预，对分化前后细胞蛋白进行2一DE分离，对差异蛋白进行质谱分析，鉴定了l6个包括细胞骨架蛋白、代谢酶蛋白、抗氧化蛋白、热休克蛋白HSP27等不同种类的蛋白，提示双龙方可能通过调节MSCs能量代谢及细胞体内氧还平衡等环节来干预其分化过程，对MSCs体外定向分化过程有一定的辅助作用。唐利华等利用双向凝胶内差异显示电泳技术，分析温补肾阳药对激素依赖性肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组的影响，共获得16个差异蛋白质，经质谱测定和与蛋白质文库比对，其中11个蛋白质得到鉴定。结果表明温补肾阳药可增加糖代谢功能，增加产量，可通过调整线粒体内多种与能量代谢相关的蛋白质表达起到治疗肾阳虚的作用。王杉等应用蛋白质组学技术，观察黄连解毒汤对快速老化模型小鼠海马组织蛋白表达的影响。发现与对照组相比，模型组小鼠海马中有8个蛋白点显著上调，21个蛋白点显著下调；与模型组相比，黄连解毒汤给药组的快速老化模型小鼠海马中有18个蛋白点显著上调，20个蛋白点显著下调。对部分差异蛋白点进行质谱分析结合数据库检索，共鉴定出l2个与能量代谢、转录调控、细胞骨架、氨基酸代谢等功能相关的蛋白，提示这些蛋白的异常表达可能与模型小鼠的老化及其脑内的病理变化相关。黄连解毒汤通过对上述老化相关蛋白的调节，使脑内的能量代谢障碍、信号转导异常及氨基酸代谢紊乱等得以改善，进而缓解老化的进程及相应的病理变化。该课题组用同样的方法观察了当归芍药散对快速老化模型小鼠海马蛋白表达的影响，发现与对照组比较。模型组海马中有9个蛋白表达下调，13个表达上调；当归芍药散组与模型组比较，海马中有14个蛋白表达下调，21个表达上调。差异表达的蛋白根据功能可分为线粒体相关蛋白、能量代谢相关蛋白、突触形成相关蛋白、细胞骨架蛋白、其他蛋白等5类。结果表明当归芍药散可影响快速老化模型小鼠海马蛋白的表达，其作用是多途径多靶点的。

　　4评价与展望

　　研究表明中药的作用方式是多靶点、多层次的整体调节方式，蛋白质组学技术是从分子水平上研究中药疗效的物质基础和作用机理的一项重要工具。从以上的资料可以看到，不少中医药工作者在这方面进行了探索，取得了一些成果。然而，从中我们也发现，目前研究主要停留在给药前后的表达蛋白质组学层面，对靶蛋白的结构、生物学意义及蛋白质问相互作用的研究较少，而研究蛋白质之间复杂的功能网络正是中药研究的关键问题。另外，蛋白质组技术尚存在不足，如操作较烦琐、对某些低丰度蛋白分辨率不高等，需要进行改进和提高。随着蛋白质组技术的日益成熟，它在中药作用机理研究方面的应用前景将越来越广阔。

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