清肺口服液拮抗呼吸道合胞病毒感染的血清药理学研究

　　呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体，约占婴幼儿肺炎病例总数的5％～40％，同时，也常引起成年人尤其是老年人的呼吸道感染，但目前尚无有效的预防和治疗方法。清肺口服液主要由炙麻黄、杏仁、葶苈子、虎杖等药物组成，临床研究取得了满意的效果…，但其作用机理尚未完全阐明。本实验欲从血清药理学方面对其做一探讨。

　　1实验材料

　　1．1动物大耳白兔14只，雌雄不拘，健康无病，体重2．5～3 k9，南京市清凉山实验动物基地提供，合格证号：SCXK(苏)2007—0008。

　　1．2细胞与病毒

   　 人喉癌表皮细胞Hep－2，由凯基生物科技细胞中心提供，本实验采用第3～30代细胞。呼吸道合胞病毒B亚型(RSV B型)，博特生物有限公司提供。

　　1．3试剂

  　　DMEM(美国GIBC0公司)：新生牛血清(杭州四季青公司)；细胞培养液：DMEM加10％新生牛血清；细胞维持液：DMEM加2％新生牛血清；0．25％胰酶(美国GIBC0公司)：3一(4，5-二甲基噻唑基)－2，5－二苯基四氮唑溴化物(MTT，AMERSSCO)；二甲基亚砜(DMS0，上海永华特种化学试剂厂)。

　　1．4仪器

   　 酶联免疫检测仪，EXL800型，美国BioTek：倒置显微镜，OLYMPUS BX－50。

　　1．5药物及含药血清的制备

 　   清肺口服液，南京中医药大学植物药研究中心提供，每剂含原药材lo m9／mL。含药血清的制备：清肺口服液给健康大耳白兔灌胃，剂量为489／(k9·d)，是临床等效剂量(129／kg)的4倍，每日分2次灌服，连续给药3 d。末次给药后禁食不禁水12 h，在家兔清醒状态下颈动脉采血，无菌分离血清，制成血清冻干粉－20℃保存备用。同时设空白对照，灌服等体积生理盐水，取血清方法同前。利巴韦林注射液：华北制药集团制剂有限公司产品，批号051202。

　　2实验方法

　　2．1分组设含药血清组、空白血清组、利巴韦林组、病毒对照组及细胞对照组。

　　2．2细胞培养将复苏后的细胞以1×106／瓶接于25 mL培养瓶中，加入3 mLDMEM培养基。置37℃、5％C02饱和湿度条件下培养。待细胞_譬麟9嘶后，用0．25％胰酶消化，进行传代培养。懿j病毒的扩增豁：特细胞在板或瓶中长满6096～70％后，吸去液体，加入适量500-1000 BL)病毒液，37℃、5％C0：培养箱中吸附2 h后，补维持液3 mL。逐日观察细胞病变(CPE，典型病变是融合的大泡），病变达75％以上时收集病毒。

　　2.4利巴韦林及含药血清最大无毒浓度测定

　　Hep－2细胞以1×105／mL浓度分种于96孔细胞板，每孔0.1mL。待8096汇合后，以DMEM稀释清肺口服液含药血清和空白血清40、20、10、5、2．5、1．25、0．625 m9／mL 7个浓度，用维持液稀释利巴韦林2、1、0．5、0．25 m9／mL 4个浓度。弃去培养液，分别加入维持液稀释后的空白血清、含药血清和利巴甫林。每孔0．1 mL，正常细胞对照组加维持液，每孔0．1 mL。每个浓度4个孔。37℃、5％C0：培养箱中培养7 d，观察各组细胞病变作用，测定不引起CPE的最低稀释度即最大无毒浓度，作为抗病毒实验的最高允许浓度。

　　2．5呼吸道合胞病毒B亚型组织培养半数感染量的测定

　　Hep－2细胞以1×105／mL浓度接种96孔细胞板，每孔O．I mL。用单培维持液l0倍系列稀释病毒悬液，共8个浓度。每次稀释更换吸管以防止病毒滴度后延。在接种细胞后1．8～36 h内。细胞长成单层时吸弃培养液，PBS洗细胞面，接种系列稀的病毒液，每个稀释度接种5孔，每孔0．1 mL，正常细胞对照孔加入0．1 mL维持液。37℃、5％C02培养箱中吸附2 h，15 min摇晃l次，使病毒均匀吸附。吸弃病毒液，每孔加入维持液0．1 mL，置37℃、5％C0培养箱中继续培养。逐日观察病变。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，细胞病变程度用“－”～“++++”表示：无细胞病变时为“一”，≤25％细胞出现病变为“+”，>25％～50％为“++”，>50～75％为“+++”，>7596为“++++”。根据Reed—Muench公式计算病毒组织培养半数感染量(TCID。)。

　　2．6加入血清的不同时间对病毒的抑制效应

　　将1×105浓度的Hep一2细胞接种到96孔培养板上，置37℃、5％C0箱培养。待细胞长成单层，在18 h内吸弃培养液。a药物和病毒同时作用于细胞：将l 000 TCIDs0／50 laL RSV B亚型和清肺口服液含药血清(10 m9／mL)、空白血清(10 m9／mL)、利巴韦林(0．2 m9／mL)各50ul分别混合，加入到含有细胞的培养板中。b药物作用细胞后感染病毒：先加入含药血清(5 m9／mL)、空白血清(5 m9／mL)、利巴韦林(0．1 m9／mL)各100，12 h后弃去上清，每孔接1000 TCID／50 laL RSV B亚型，置37℃、5％c02箱吸附2 h。吸弃病毒液，分别加入用2％维持液，每组5个复孔，每孔100，置35℃、5％C02培养箱。每日在倒置显微镜下观察细胞病变。72 h后加入MTT(用维持液稀释1m9／mL)，每孔20ul，置37℃、5％C02培养箱，160 min后，小心吸弃上清，加入DMS0，轻轻振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长在酶联免疫酶标仪上检测药物的细胞活性作用(0D值)，判断药物对细胞的保护作用。

　　3统计学方法

　　实验结果以x+s表示。应用SPSS11．5统计分析软件对实验数据进行统计学处理，采用方差分析。

　　4结果

　　4．1  空白血清、含药血清和利巴韦林在Hep一2的最大无毒浓度测定结果

   　 在Hep-2中，空白血清的最大无毒浓度为lo m9／mL；清肺口服液含药血清的最大无毒浓度为10 m9／mL；利巴韦林的最大无毒浓度为0．2 m9／mL。

　　4．2呼吸道合胞病毒组织培养半数感染量结果在Hep－2中，RSV B亚型(r6株)TCIDs0为l0～4．83／50ul。

　　5讨论

    　上呼吸道感染的发生约90％rh病毒引起，RSV是引起本病的主要病原之一。针对病毒感染，西医主要采用病毒唑为主的治疗。但尚存在一些问题：小剂量应用时治疗效果差，大剂量时会在红细胞中蓄积，对人体造成伤害。而现代研究显示，中药在防治病毒感染性疾病方面有一定的优势。由于以往经常采用中药复方粗提取物直接加入反应体系的方法，干扰因素大，不能反映药物在体内真实的代谢过程。而中药血清药理学在一定程度上避免了上述缺点，是研究中药复方的重要方法。

    本实验结果表明，清肺口服液具有拮抗RSV感染的作用，与利巴韦林相比无明显差异，并且具有较高的安全性，以1：4比例稀释后对正常细胞不表现出毒性作用。在此基础上，我们进一步研究了清肺口服液的可能作用环节，结果两种方法之间无明显差异，说明清肺口服液对RSV感染的不同环节均有一定的拮抗作用。由于血清药理学是一门年轻的学科，自身仍有许多不完善的地方，如目前血清中有效药物成分的药代动力学不清楚，不知何时是药物的最高血药浓度，从而导致采血时间难以确定。因此，我们借鉴了通用的方法，即每日2次喂药，连续3 d，末次喂药后I h采血。下一步我们将进行预实验，根据量一效关系，确定清肺口服液的最佳采血时间，以求实验的严谨性和科学性。

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