苦参碱诱导胶质瘤模型大鼠胶质瘤细胞凋亡的实验研究

　　大鼠c6脑胶质瘤模型是常用的筛选抗肿瘤药物的动物模型，是一种较为理想的模型系统，C6细胞是经N一亚硝基甲脲(N—nitrosomethylurea)诱发的大鼠脑星形胶质瘤细胞，与大鼠脑组织有很好的相容性，成瘤率高且生长快，具有与自发生长的脑胶质瘤一样的生长和浸润特征，其血管增生与人脑胶质瘤侵袭性生长较为接近[3]。本实验建立了大鼠脑胶质瘤模型来研究苦参碱对胶质瘤的治疗作用。

　　1实验材料

　　1.1实验动物健康成年Wistar大鼠40只，雌雄不限，体重(200±20)9，由哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心提供。

　　1.2细胞系大鼠胶质母细胞瘤c6细胞系：购自哈尔滨医科大学神经微生物实验室。

　　1.3药品及主要试剂制苦参碱溶液：苦参碱粉剂购自陕西慧科植物开发公司(N0.MA20070302，纯度98％)。将苦参碱溶于生理盐水中，制成2(hn9／ml的溶液，然后滤过除菌，4℃保存备用。冰片溶液：冰片购自北京同仁堂药店。取log过140目筛的冰片溶于100ml的1％羧甲基纤维素钠助溶液中，制成0.19／ml的冰片溶液，4℃保存备用。一抗(BID)：美国Santa Cruz生物工程有限公司产品。SP一9001免疫组化试剂盖：北京中杉金桥生物公司。

　　1.4主要仪器  立体定位仪：NARISHIGE，Et本。MRl仪：TOSHIBA UISART l.5T，日本。

　　2实验方法

　　2.1  大鼠脑胶质瘤动物模型的建立大鼠模型制作参照文献进行。

　　2.2  实验动物分组及给药  模型组：经MRl检测后成模的Wistar大鼠lO只，标准饲养环境下饲养7天后处死大鼠，断头取大鼠脑组织，进行检测。冰片组：10只，每日给予冰片溶液0.5g/kg灌胃。低剂量组：l0只，每日给予冰片溶液0.59，k9灌胃后，立即给予苦参碱溶液50mrCks腹腔注射。高剂量组：l0只，每日给予冰片溶液0.5g/kg灌胃后，立即给予苦参碱溶液100neCks腹腔注射。以上各组大鼠处理1周后，再进行MPd检测。

　　2.3脑组织取材

　　2.3.1新鲜组织取材大鼠腹腔注射l0％水合氯醛2.3ml(致死量)，待大鼠死亡后，立即断头。将取下的脑组织放入液氮罐中保存备用。

　　2.3.2固定组织取材采取内灌注的方式进行取材。

   　 大鼠腹腔注射l0％水合氯醛O.6～0.8ml进行深度麻醉，然后将麻醉后大鼠固定在鼠板上，剪开胸骨，充分暴露心脏。剥离主动脉，在左心尖上剪一2nma X 2mm切Vl，从左心尖沿主动脉方向插入细管，然后在主动脉外将管固定并在右心耳处剪开一2nma×2mm切口。先用100～120m1温生理盐水经插管冲洗血管内血液，至右心耳流出的液体澄清后，再灌注4％的多聚甲醛l00—120ml，断头取脑，置于4％的多聚甲醛中固定l2小时，然后沿注射点行矢状面切开，固定l2小时后，进行脱水、石蜡包埋。

　　2.4观察指标

　　2.4.1大鼠的生存状态包括精神状态、皮毛色泽、食欲、体重、活动及死亡率等。

　　2.4.2标本大体所见包括肿瘤的色泽、质地、包膜、边界、生长方式、体积及继发性改变。

　　2.4.3 MRl成像肿瘤体积=n／6×A x B x C，A，B，C分别为横、矢和冠状位MRl增强扫描图像中所测得的最大前后、左右和上下径(ram)。

　　2.4.4病理组织学观察  对切片进行苏木素，伊红染色。结果在奥林帕斯BX51光学显微镜下观察分析。

　　2.4.5 BID的蛋白表达测定  免疫细胞化学方法检测。结果使用I-IMIAS一2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行定量分析，计算目的蛋白表达的平均光密度值(me.an opticaldensity，MOD)。

　　2.4.6 BID蛋白半定量检测  Western—blot法。结果通过上海天能科技公司图像拍摄处理软件进行条带灰度比值对目的蛋白表达进行相对定量。

　　2.5结果判定与统计学处理采用统计软件SPSSll.5进行统计。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK方法。

　　3结果

　　3.1大鼠生存状态观察  于接种c6细胞后10天，模型大鼠出现颅内高压症状，表现为精神萎靡、运动量下降、攻击性下降、毛色失去光泽、食欲不振、体重下降。各组不同处理l周后，模型组与冰片组大鼠颅内高压症状明显加重，体重明显下降，面容不洁，有的大鼠出现了眼周淤血，甚至出现偏瘫、癫痫的症状。其中，模型组死亡l只，冰片组死亡2只。而低剂量组与高剂量组大鼠无颅内高压明显加重的表现。

　　3.2标本大体观察模型组大鼠尾状核区均见团块状肿瘤形成，肿瘤呈不规则形或椭圆形，无包膜，新鲜标本肿瘤组织较周围正常组织颜色深，边界较清楚。肿瘤切面实性、色白、呈鱼肉状。经过实验各组不同处理1周后，模型组与冰片组的大鼠肿瘤体积明显增加，肿瘤向周围脑组织浸润性生长，脑组织中线结构明显移位，占位效应愈来愈明显，瘤组织内出血坏死愈来愈明显。而低剂量组与高剂量组大鼠肿瘤体积的增加明显受到抑制，部分大鼠肿瘤内可见钙化灶。

　　3.3肿瘤体积在接种c6细胞后10天的模型大鼠，其肿瘤体积为(14.12±1.o5)mm3。经过实验各组不同处理1周的模型组与冰片组的大鼠肿瘤体积明显增加，分别为(79.244-2.59)mm3及(81.17±3.06)mm3，而低剂量组与高剂量组分别为(53.384-1.69)1mm3及(39.744-2.93)rnm3，与前两组相比均有显著性减小(P<0.05)。

　　3.4组织学观察脑胶质瘤大鼠模型，其胶质瘤均为星形细胞瘤Ⅱ级、Ⅲ级，表现为瘤细胞丰富密集，多数瘤细胞分化较低，偶见瘤巨细胞，核分裂象少见，血管增生较丰富。经过实验各组不同处理l周后，模型组与冰片组的胶质瘤中常见坏死出血区，而苦参碱各剂量组的胶质瘤中偶见钙化灶。

　　3.5 BID蛋白表达的测定结果见表1。

　　　　　　　　表1苦参碱对大鼠脑胶质瘤c6细胞BID表达的影响(x±s)

模型组         9                  45.634±9.80         0.874±0.15

冰片组         8                  46.124±5.80         1.084±0.13

低剂量组      l0                  67.50±8.84**        2.164±0.17*

与模型组和冰片组比较*P<0.05，**P<0.01；与低剂量组 比较△P<0.05，△△P<0.01

　　4讨论

    　神经胶质瘤目前治疗上多采用综合疗法，包括手术切除、放射治疗及化学治疗等，其中化疗在脑胶质瘤的综合治疗中占有举足轻重的地位。近年研究表明胶质瘤的化疗一直存在两大问题：一是药物敏感性的问题。而在之前的实验中对苦参碱抑制胶质瘤细胞增殖、诱导其程序性细胞死亡的作用给以了充分的肯定。二是血脑屏障问题。中枢神经系统的毛细血管系统具有选择性渗透功能，维持脑内生化环境稳定，它阻止化疗药物渗透进肿瘤区，是脑肿瘤化疗效果难以提高的关键因素之一。冰片具有“芳香走窜，引药上行”的功效，在中枢神经系统疾病的治疗中具有开放血脑屏障作用。刘启德等实验证实冰片能显著增加血一脑屏障(BBB)的通透性，提高脑组织中药物浓度。本实验中各个苦参碱治疗组在治疗过程中，均采取先灌服冰片溶液，然后立即腹腔注射苦参碱溶液的方式，以保证苦参碱能够透过血脑屏障，确保苦参碱发挥其治疗作用。

    　本实验通过MRl检测观察肿瘤体积的大小、HE染色及IHC检测观察细胞凋亡等情况，证实苦参碱对脑胶质瘤具有抑制作用，且具有明显的剂量依赖关系。

   　 细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、消退有密切关系，诱导细胞凋亡可能是抑制肿瘤生长的机制之一。因此，程序性细胞死亡的研究已成为国际形态学和分子生物学研究的新热点。苦参碱(maine)是从中药苦参(Sophora fiawescens Ait)干燥根中提取的一类活性物质，是苦参所含的主要生物碱成分之一。近年来，苦参碱的抗肿瘤作用日益受到重视，苦参碱具有较广的抗瘤谱，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率。苦参碱具有多种抗肿瘤作用靶点。其中，大量研究结果表明苦参碱具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

   　 细胞凋亡的经典途径有2条：线粒体途径和死亡受体途径。越来越多的实验表明，Bd一2家族成员在细胞凋亡的线粒体途径中起重要作用。研究显示，抗凋亡类Bcl一2蛋白(Bd-2、Bd-xL等)可以通过与促凋亡类Bd一2蛋白(Bax、Bak)形成异源二聚体从而达到调控凋亡的目的，抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例决定了细胞是否发生凋亡。但最近一些观点认为，对Bd一2蛋白的中和作用不足以导致细胞凋亡。因为Bax本身不是很活跃，它需要BH3-ONLY蛋白如Bim和Bid的直接激活。Bim和Bid在胞浆中以被Bcl-2或Bcl-xL结合状态存在，当Bim和Bid被激活以后，它们会直接对Bax和Bak活化而在线粒体膜上形成渗透孔，从而将凋亡信号向下游传送，而引起一系列的下游事件，最终导致凋亡。本实验中，通过Western—blot及IHC结果显示苦参碱能诱导大鼠胶质瘤细胞的BID表达上调，因此可以推测苦参碱诱导大鼠胶质瘤细胞凋亡可能是通过线粒体途径，以上调BID表达来实现的。

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