川芎嗪黄芪复方注射液对大鼠急性期脑出血不同时段作用的实验研究

　　脑出血是常见的脑血管疾病，其病死率、致残率高，严重影响患者的生命及生存质量。应用活血化瘀中药治疗急性期脑出血取得良好的疗效，但应用活血化瘀中药治疗急性期脑出血，在安全性、应用时间窗以及病机病理、治疗方面等存在争论。本研究通过动物实验验证川芎嗪黄芪复方注射液治疗急性期脑出血的疗效，探讨活血化瘀类中药治疗急性期脑出血的应用时间窗及其作用机制，为活血化瘀类中药治疗急性期脑出血的应用时间窗提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料川芎嗪注射液：无锡市第七制药有限公司，批号050508110。黄芪注射液：成都地奥公司，批号：0706027。Ⅶ型胶原酶：美国Sigma公司。免疫组化检测试剂盒ENvid∞Tw0—Step Histostaining Reagent：丹麦DAK0公司提供。Rabbit来源的多克隆抗体AQP,：美国Labvision IVeoMarkers公司。立体定位仪：第二军医大学生产。HPIAS一1000病理图文分析系统：中国武汉同济千屏影像工程公司。SD大鼠：8周龄，清洁级，雌雄各半，体重(200±10)9，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。

　　1.2动物模型复制  参照Rosenber9…造模方法。大鼠经10％水合氯醛按4tX)ln9，k9体重腹腔麻醉后，将大鼠固定于立体定位仪上，行头皮正中切口，剥离骨膜，暴露前囟，于前囟前lmm线向左旁开3mm处钻一直径为lmm的小孔，用固定于立体定位仪上的微量注射器沿钻孔进针，深度为5.9mm(左侧尾状核位置)，缓慢注射含0.1U／ulⅦ型胶原酶的生理盐水5m，注药后留针l0分钟，退针缝合皮肤，术后观察神经症状和体征。

　　1.3动物分组与给药处理60只sD大鼠随机分为6组，每组l0只。分别为假手术组：仅开颅不注入胶原酶，造模后12小时腹腔内注射生理盐水lml。模型组：用胶原酶脑内注射作脑出血模型，造模后l2小时腹腔内注射生理盐水lml。6、12、24、36小时治疗组：造模后6、12、24、36小时分别腹腔内注射川芎嗪黄芪复方注射液，以后每12小时给药l次；川芎嗪黄芪复方注射液剂量每次按川芎嗪80mg/kg、黄芪8g/kg给予。实验期间对动物的进食、饮水不予限制，以上各组连续给药，造模后5天断头处死取脑。

　　1.4动物残疾评分评定依据Zausinger法进行残疾评分评定。0分：不能自发行走；1分：自由走动状态下向病变对侧旋转；2分：抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转；3分：对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降；4分：能伸直病变对侧前爪，甚至全身向对侧屈曲；5分：无神经功能缺损。评分采用双盲法。假手术组大鼠均无神经功能缺损，均人组。在造模后3天给予残疾评分。

　　1.5脑血肿体积计算60只大鼠采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经左心室行主动脉插管，钳夹腹主动脉，剪开右心耳，快速灌注生理盐水冲洗血液，直至由右心耳流出的液体变清亮后，继之以10％的中性缓冲福尔马林pH(7.4)200ml灌注固定，先快后慢，共持续20分钟左右，剪开颅骨，取出脑组织，立即放在10％中性缓冲福尔马林固定液中固定。取材时测量脑出血的多少以及出血区最大切面测量其长和宽，然后进行组织的脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片，标本从后至前以2mm为一间隔作冠状等距切片，选用有血肿的切片行常规HE(苏木素一伊红)染色后用装有体视测试系统的光学显微镜计算血肿体积。

　　1.6水通道蛋白4(aquaporin一4，AQP,)表达测定免疫组化方法。免疫组织化学染色的AQp4阳性细胞胞膜和胞腔呈棕黄色。采用HPIAS一1000高清晰度彩色医学图像分析系统定量分析阳性细胞平均吸光度(A)值。

　　1.7统计处理实验数据用(x±s)表示，用SPSSl0.0统计软件处理，采用方差分析(q检验)和t检验。

　　2实验结果

　　2.1一般情况所有大鼠无一例死亡，模型组2只大鼠，6小时、24小时、36小时治疗组各3只大鼠未见明显血肿，造模失败。假手术组大鼠一般情况良好，造模各组大鼠部分全身向对侧屈曲，自由走动状态下向病变对侧旋转，甚至不能自发行走。

　　2.2川芎嗪黄芪复方注射液对脑出血大鼠残疾评分、血肿体积及脑组织AQP4表达的影响见表1。

假手术组   l0          5.00+0.00**            -                41.19±2.351

模型组     8           2.10±0.48         25.06±2.653         21.666±2.221

6h治疗组   7            1.94+0.00          25.682±1.825        19.839±2.1931

12h治疗组  10          2.6／±0.50         20.405+2.433         26.46±1.821★

24h治疗组  7           2.50±O.45。      　21.8ff／±2.112      24.364+1.715**

    与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与6h组比较△P<0.05，zxzxp<0.01；

3讨论

    　脑出血在中医多属脑部脉络破损，血流不循常道，溢出脉络之外，停积于局部而成血肿、血块。目前认为脑出血是离经之血属于瘀已成共识H’5]，故凡血证总以去瘀为要，瘀血不去则出血不止，新血不生。瘀血既为脑出血之病理基础，又为脑出血之病理产物，故活血化瘀为脑出血急性期治疗之关键。从80年代到现在，国内已有不少关于小样本应用活血化瘀药治疗急性期脑出血的报道，结果表明：活血化瘀治疗急性期脑出血(发病7天内)可能有效，有降低脑出血患者病死和严重致残的趋势。本研究发现川芎嗪黄芪复方注射液12、24、36小时治疗组能明显减轻脑出血大鼠神经功能障碍程度，其中以12小时治疗组减轻最明显；而6小时治疗组有加重大鼠神经功能障碍程度的可能。因此川芎嗪黄芪复方注射液在一定时间窗对脑出血后的神经细胞损伤有明显的保护作用。

    　杨万章认为不同活血化瘀中药应分别用于脑出血的不同时期，大黄三七活血作用迟缓，可用于脑出血超早期，破血类药如水蛭破血作用强大不宜用于脑出血超早期，活血化瘀代表药丹参可用于脑出血急性期。本实验表明6小时用川芎嚓黄芪复方注射液治疗大鼠急性脑出血有扩大血肿体积，继发出血的可能；而l2小时以后(包括l2小时)用川芎包括l2小时)用川芎嗪黄芪复方注射液治疗大鼠急性脑出血可使血肿体积明显减小，尤以12小时治疗组效果最佳。本研究说明活血化瘀治疗急性期脑出血有应用时间窗。

    　脑出血后脑水肿是导致病情恶化及影响临床预后的关键因素。近年来发现一种对水有高度选择性的细胞膜转运蛋白AQP,(aquaporin4，水孔蛋白4)与脑出血后脑水肿的发生关系密切，AQP,主要分布于脑内胶质细胞膜及室管膜细胞，在朝向血管及软膜面星形胶质细胞膜区选择性地高表达，是胶质细胞与脑脊液及血管之间水调节和运输的重要结构基础一]，当AQP,功能失常或结构破坏，诱导表达升高时，引起血脑屏障通透性的改变，从而诱发脑水肿。

    　本实验应用川芎嗪黄芪复方注射液治疗大鼠急性脑出血表明：6小时内应用有提高AQP,表达，增加脑水肿的可能；而l2小时以后(包括l2小时)应用可使AQP,表达降低，尤以l2小时治疗组降低最明显，说明川芎嗪黄芪注射液在适当时间窗具有活血化瘀，减轻脑水肿的作用。因此应用活血化瘀中药治疗急性期脑出血是可行的，只是应该注意应用的时机。活血化瘀中药种类很多，活血程度不同的中药其应用时机可能也存在差别，有待以后实验和临床进一步完善。黄芪是常用的理气药，他的主要成分是黄芪多糖、黄芪总黄酮等。川芎嗪是我国传统具有活血化瘀作用，同时又可理气、疏风止痛的中药川芎中的一种生物碱。临床上常用于缺血性心脑血管疾病。本实验应用川芎嗪黄芪复方注射液进行了大鼠脑出血模型的实验研究，表明此复方注射液具有更多的作用靶点。

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