针灸预处理对缺血再灌注大鼠肌细胞凋亡及C—fos基因调控六
心肌缺血预处理是一种最为有效的内源性保护机制，其特点是保护作用强，保护范围广，它除了可以减少心肌梗死的范围，推迟其发生的时间外，还可以降低室性心律失常的发生次数和严重程度，并能改善左心室收缩功能以及减轻内皮细胞的损伤。针灸对缺血心肌具有保护作用已得到证实。“针刺预处理是中国黑龙江中医药大学的孙忠人等在2004年“针刺预处理对全脑缺血大鼠影响”的实验中提出的。报告中认为提前给予每日1次共7天的针刺处理使脑细胞在随后的持续性缺血中产生很强的抵抗力，从而得到保护，这一现象称为“针刺预处理”。随着研究的深入，孙忠仁教授又于2005年，在“艾灸预处理对全脑缺血大鼠影响”的实验中证明“艾灸预处理”现象客观存在并且有效，效果等同于缺血预处理，甚至在某些指标检测中优于缺血预处理。2006年研究“针刺预处理”缺血大鼠保护机制，实验证明针刺预处理对大鼠心肌缺血具有保护作用。“针灸预处理”是采取以上两种方法结合，本实验观察针灸预处理“膻中”、“内关”对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响，在实验中进一步明确针灸预处理量化标准，进一步从生物化学角度探讨“针灸预处理”的心肌保护机制，为针灸“治未病”理论在临床的应用提供实验依据。
一、材料与方法
1．设计
随机对照实验。
2．材料
取wistar健康雄性大鼠，体重250+20g，清洁级，常温常湿，自由饮水。
3．实验动物分组及模型制备
(1)分组。
经筛选取80只大鼠随机分为10组，每组8只。①正常对照组：常规饲养。②假手术组：开胸后暴露心脏不做其他处理。③缺血再灌注组：开胸后缺血20min，再灌40min。④缺血预处理组：开胸后缺血5 rain再灌5min循环3次，然后缺血20min再灌40min。⑤手针预处理日一次组：在缺血20rain再灌40min前7d给予针刺。用0．25mmx25mm毫针针刺大鼠双侧“内关”穴，直刺进针3ram，同时用0．25mmx25ram毫针针刺大鼠“膻中”穴，平刺进针5ram，1次／ d，时间30min，共针刺7d。⑥电针预处理日一次组：在缺血20 min再灌40 min前7d给予电针。右“内关”和“膻中”穴连接KWD-808Ⅱ型全能脉冲电疗仪，频率为1HZ，电压为0．1V，强度以肢体轻微颤动为度，1次／d，时间30rain，共针刺7d。⑦艾灸预处理日一次组：在缺血20rain再灌40min前7d给予艾灸。用长lOem直径lcm粗自制清艾条悬浮艾灸大鼠双侧“内关”穴，同时艾灸大鼠“膻中”穴，1次／d，时间30min，共艾灸7d。⑧手针预处理日两次组：日两次手针，余同5组。⑨电针预处理日两次组：日两次电针，余同6组。⑩艾灸预处理日两次组：日两次艾灸，余同7组。
(2)在体心肌缺血再灌注损伤模型制备。
改进的线穿法结扎冠状动脉前降支。
(3)观察指标及测定方法。
取大鼠左心室缺血心肌，严格按照试剂盒说明原位杂交法测定C-fosmRNA，TUNEL法测细胞凋亡。
(4)统计学分析。
采用SPSSl3．0统计软件做分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析，q检验。 P<O．05时判定差异有统计学意义。
二、结果和讨论
1．实验动物数量分析
纳入的80只大鼠实验中，筛选后各组大鼠体
质、手术时间及手术肛温比较无显著性差异。
2．分才斤性结果(见表l、表2)
3．结果
(1)在手针预处理、艾灸预处理、电针预处理日一次与日两次比较中发现，日两次3组中细胞凋亡均显著少于日一次的三个组(P<0．05)，C-fosmRNA显著增多(P<O．05)，说明日两次优于日一次，时间频率与预处理疗效有一定关系，且频率大效果好。
(2)缺血再灌注组与缺血预处理相比，后者细胞凋亡均显著减少(P<0．05)，C-fosmRNA显著增多(P<0．05)。说明模型组、对照组造模成功，缺血预处理有效抑制缺血再灌注带来的细胞凋亡损伤。
(3)针灸预处理与缺血预处理相比，日两次3组优于缺血预处理，说明针灸预处理日2次对预防缺血性心肌病更有效。
(4)针灸预处理后C-fosmRNA增多，而细胞凋亡减少，一致说明针灸预处理可通过刺激缺血再灌注大鼠产生更多抗凋亡物质而减少其细胞凋亡，从而达到保护心肌作用。
三、结论
(1)针灸预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞具有保护作用，可通过刺激缺血再灌注大鼠产生更多抗凋亡基因C-fosmRNA而减少其细胞凋亡。为更安全有效防治缺血性心肌病提供新方法、新思路。
(2)针灸预处理中每日2次预处理方法更有效。
(3)从生命科学角度丰富了中医“治未病”理论科学内涵。
四、讨论
本实验正常对照组及假手术组术后心肌组织C— fosmRNA基因表达和细胞凋亡无明显差异。缺血再灌注组C-fosmRNA基因表达，细胞凋亡明显下降，与假手术组及正常对照组比较，差异显著，说明心肌缺血再灌注的急性期可产生大量细胞凋亡，并C-fosm- RNA基因表达明显下降，对心肌组织具有明显的破坏作用。缺血预处理组、针灸预处理组后C-fosmRNA基因表达明显提高、细胞凋亡下降，与缺血再灌注组比较具有显著性差异。缺血预处理组后C-fosmRNA基因表达上升明显，但针灸预处理组间比较无明显差异。显示缺血预处理和针灸预处理均能提高c—fosmRNA基因表达，降低细胞凋亡。提示缺血预处理、针灸预处理可通过内源性抗凋亡物质的增加对缺血心肌组织起保护作用。针灸预处理日2次组较针灸预处理日1次组均能提高C-fosmRNA基因表达，降低细胞凋亡；说明针灸预处理日两次更能有效地预防性保护心肌，提高心肌抗凋亡，进而提高心肌组织对缺血的耐受性，减轻缺血性心肌损伤，达到预处理的目的。
针灸治疗心血管疾病历史悠久，从古典医籍的论述到近代程莘农、陈可冀、石学敏等学者均认为针灸膻中、内关有防治心血管疾病的作用。本试验在前人研究的基础上，创新推出“针灸膻中，内关预处理”办法，结合中医针灸“治未病”理论，通过试验研究证明：针灸预处理日2次与日1次组，与以往的缺血预处理比较，有使心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞抗凋亡基因C-fosmRNA增多，细胞凋亡减少的作用，最终达到保护心肌的目的。针灸日一次和日2次组中手针、电针、艾灸比较无差异，说明针灸预处理手段包括手针、电针、艾灸预处理均有相同效果。关于如何实现其抗细胞凋亡，如何使抗凋亡基因C-fosmRNA增多、细胞凋亡减少有待进一步研究。
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