鸡血藤提取物体内抗肿瘤效应及对造血功能的影响

　　鸡血藤是常用的养血活血药物，中医临床常用于治疗肿瘤中晚期患者的血瘀证。国外有文献报道，鸡血藤分离组分能诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤转移。前期实验证实，鸡血藤水提物体外对6种肿瘤细胞系具有抗增殖作用，在此基础上，进一步采用聚酰胺柱层析技术和梯度乙醇洗脱的方法，从鸡血藤水提物中分离得到化合物SSCE，体外实验对A549细胞有明显杀伤作用，24 h药效最强，ICso值为25.54μg／mL。前期体内实验发现其具有较强的抑瘤率，确定了其最适剂量。本次实验选择该剂量作为治疗剂量，同时对小鼠造血功能进行检测，旨在从抑瘤、刺激造血两方面研究其药理作用。

　　1.实验材料

　　1.1仪器

　　万能显微镜Olympus-VANOX(日本Olympus公司)；血液分析仪MEK-5216K(日本光电公司)。

　　1.2药物

　　鸡血藤(Spatholobus suberctus Dunn)饮片，购自北京卫仁中药饮片厂(批号603305101)。

　　1.3动物与瘤株

　　选用清洁级C57BL／6小鼠，雌性，体重18～20 g，中国医学科学院动物研究所提供，许可证号：SCXK京2004-0001。Lewis肺癌细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供。

　　1.4试剂

　　30％乙醇(AR)，北京化工厂生产；聚酰胺(30～60目)，江苏临江试剂化工厂生产。

　　2.实验方法

　　2.1鸡血藤提取物的制备

　　SSCE由北京市中医研究所药理药化室提取。将药材碎成小块(2 500 g)，加去离子水浸泡1 h，回流提取2次，120目筛滤过。合并提取液冷藏过夜，取上清浓缩至稠膏，真空干燥(温度60℃、真空度0.01 Pa、时间6 h)，取干膏水溶解，上已处理好的聚酰胺柱(柱直径5 cm、柱高40 cm，水洗至流出液澄明后备用)。换不同浓度乙醇(0％、30％、95％)梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，回收乙醇至无醇味，经水浴蒸干，真空干燥得洗脱物，即SSCE 13.89 g备用。

　　2.2建立Lewis荷瘤C57BL／6小鼠模型

　　将液氮冻存的小鼠Lewis肺癌细胞复苏后，先接种3只C57BL／6小鼠右腋窝皮下传代，将荷瘤14 d的小鼠以颈椎脱臼法处死，固定、消毒，剥离肿瘤，选取生长良好、有光泽的瘤组织块，剪碎研磨，加生理盐水稀释成单细胞悬液并计数，调整细胞浓度5×106／mL，台盼蓝拒染实验示活细胞数大于95％，于每只小鼠右腋皮下接种0.2mL，约1×106／只。24 h后称重、给药。

　　2.3体内抑瘤实验

　　将C57BL／6小鼠40只随机分为模型组、化疗组(环磷酰胺)、中药组(sSCE)、联合组(环磷酰胺加SSCE)，共4组，每组10只。每只小鼠按20 g体重计，中药3 mg／O.3 mL灌胃，环磷酰胺O.6 mg／O.2 mL腹腔注射。中药治疗(中药组和联合组)于接种后第2日灌胃给药，模型组以生理盐水0.3 mL灌胃，连续给药14 d。环磷酰胺治疗(化疗组和联合组)于接种后第3曰开始腹腔注射给药，隔2 d给1次，共4次。观察指标：用游标卡尺每隔2 d测定肿瘤直径(肿瘤长径和肿瘤短径)，绘制生长曲线。取材时，剥离肿瘤组织称重，计算抑瘤率：抑瘤率(％)=(1-实验组平均瘤重／对照组平均瘤重)×100％。实验结束，各组小鼠眼眶取血，检测WBC、RBC、PLT计数。取胸骨骨髓涂片，油镜下观察骨髓像改变。

　　2.4 统计学方法

　　所有数据采用SPSSl3.0统计分析软件处理，以x±s表示。组间采用方差分析，以P<O.05为具有统计学意义。

　　3.结果

　　3.1鸡血藤提取物对小鼠Lewis肺癌的抑制作用(见表1)

表1各组小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用比较(x±s)

模型组    10    　3.85±0.91

化疗组    10    　1.03±0.53*     72.45

中药组    10    　2.67±1.30      30.65

　　注：与模型组比较，*P<0.05(下同)3.2各组生长曲线比较 结果提示：化疗组及联合组肿瘤从开始到结束生长受到明显抑制。中药组肿瘤生长受到一定程度抑制，接种后9d模型组肿瘤迅速增长，中药组肿瘤生长受到一定的抑制。

　　3.3鸡血藤提取物对荷瘤小鼠血象影响(见表2)

表2实验结束时鲁组小鼠血象的比较(x±s)

模型组  10    5.48±1.07    3.25±0.34       583.44±93.23

化疗组  10 　 2.94±1.17*   3.00±0.77       585.89+1 01.57*

中药组  10  　6.45±2.57    3.45±0.97       501.33±116.75

　　3.4鸡血藤提取物对小鼠骨髓的影响 模型组：骨髓增生活跃，粒系、红系、巨核系统形态及比例大致正常。化疗组：骨髓增生活跃，粒系早期细胞比例增多，细胞核浆发育不平衡，有成熟障碍现象，退化细胞较多见；红系形态比例大致正常；巨核系统增生良好，但血小板较其他组略有减少。中药组：骨髓粒系增生明显活跃，分类以杆状分叶为主，比例增高；红系统增生明显活跃，比例明显增高；巨核系统增生正常。联合组：骨髓增生活跃，粒系早期细胞比例减少，部分有成熟障碍现象，退化细胞偶见，巨核较模型组减少。

　　3.5鸡血藤提取物对荷瘤小鼠体重的影响(见表3)

表3各组小鼠治疗前后体重比较(x±s，g)

模型组    10    19.92±0.73    18.64±1.08

化疗组    10    19.57±0.83    17.11±O.64*

中药组    10    19.43±0.69    18.44±0.66

　　4.讨论

　　鸡血藤是一味养血活血中药，中医古籍记载用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症。现代药理研究表明，鸡血藤具有促进骨髓造血、改善血流动力学、降压、双向调节免疫功能、抗病毒作用。基于以上药理作用，临床上常用鸡血藤或与其他药物组方治疗各种原因引起的白细胞减少症、再生障碍性贫血、原发性血小板减少性紫癜等。国内有临床研究表明，恶性肿瘤患者在化疗同时口服鸡血藤煎剂，其白细胞下降程度明显比单纯化疗为轻，认为该药对于防治肿瘤化疗后白细胞下降有较好的效果。动物实验表明，鸡血藤煎剂可促进正常及贫血小鼠骨髓细胞增殖；亦有报道，鸡血藤中分离出的SS8单体可显著刺激骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖。

　　鸡血藤具有刺激骨髓造血功效，但有关其抗肿瘤作用的报道甚少，我们前期研究发现，鸡血藤水煎剂体外对6种细胞系(A549、HT-29、PG、PANC-1、SMMC-7721、IEC-6)有生长抑制作用，对小鼠移植性H22肝癌和Lewis肺癌也有一定抑瘤效果。为进一步探讨鸡血藤的有效抗肿瘤成分，我们采用柱层析技术分离提取得到化合物SSCE，体外实验对A549细胞有明显杀伤作用，24 h药效最强，IC50值为25.54 μg／mL。

　　本实验选择SSCE进行体内抗肿瘤研究，同时观察其对造血功能的影响。试图筛选出具有抗瘤及刺激造血双重功能的鸡血藤组分。结果发现，SSCE具有抗肿瘤效应，抑瘤率达到30.65％。化疗与SSCE结合应用并不能使抗肿瘤作用加强，说明中药与化疗合用无增效作用。化疗组白细胞明显减少，而中药组白细胞无明显下降。骨髓涂片证实，中药组骨髓增生明显活跃，粒系、红系增殖旺盛。SSCE加化疗组白细胞虽较模型组有所下降，但无显著性差异，说明化疗加中药在抗肿瘤方面无增效，但在减轻其骨髓抑制方面有一定作用。同时，化疗组及联合组的体重明显下降，说明化疗可减弱荷瘤小鼠的体质状态，而 SSCE组体重无明显减轻，说明鸡血藤具有抗瘤作用且不影响小鼠体质状态。

　　本实验结果表明，SSCE具有抗肿瘤活性，其抑瘤作用弱于环磷酰胺，但可促进骨髓增殖，与化疗药合用可减轻化疗的骨髓抑制作用，同时，SSCE作用的荷瘤小鼠体质状态不受影响。本研究从动物实验角度证实，SSCE具有抗癌、刺激造血的双重功效，与化疗药合用可减轻其骨髓抑制作用。

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