中药指纹图谱研究现状

黄青萍，蔡乐，滕茜华 (广西医科大学第三附属医院，广西南宁 530031) 目前人们越来越关注生活质量，尤其是与健康和长寿有关的医疗和保健消费。例如，许多人已从过去的被动取药、按方吃药转变到现在的主动询问用药方法，注意药品主治、禁忌症、服药注意事项以及有效期等，同时人们对中药及中成药的毒副作用也有新的认识，因而药品的质量越来越受到重视。现就中药指纹图谱对中药质量控制的意义及其研究现状介绍如下。 1 中药质量控制的难度 中医处方均以药味入药，常常配伍组方，且大部分中药的有效成分不完全明确，其中已知的有效成分往往不能代表其中药的全部疗效。由于中药来源复杂，同名异物、同物异名现象非常普遍，同一品种由于其生态环境、栽培条件、采收时间、采收地点、加工炮制方法、贮存条件等的不同，其有效成分便会有所差异，剂量不同也会影响疗效，这一切均给质量控制带来很大困难。 2 制订中药质量标准的意义 中药材及其制剂的发展大体分为以药效作为监测指标的传统剂型、以生物利用度作为监测指标的近代剂型、以最佳血浓度作为监测指标的现代剂型和以靶向和控释作为监测指标的未来剂型4个阶段。随着时代的发展，中药剂型必须向既符合中药制剂的特点，又符合当代快节奏生活方式的方向发展。因此用中药指纹图谱建立和完善符合中医药特点和国际认可的中药质量标准，并使之逐步被推广到世界天然药物研究和开发中，是推动中药现代化的重要基础工作。 3 中药指纹图谱的研究现状 中药指纹图谱以系统的化学成分研究的药理学研究为基础，结合先进的分析测试、数学统计手段以及计算机模拟方法学，将中药的特征和有效成分以图谱的形式描绘出来，以反映中药所含成分的种类和数量，从而进行真伪识别、种间识别等，以确定其质量和疗效。它具有特征性、专属性、可量化性、稳定性、重现性、再现性、有效性、完整性和指纹图谱细节处理的模糊性等特点。 1)薄层色谱(TLC)指纹图谱：TLC即用固定波长对薄层展开的各斑点进行薄层扫描，扫描的图谱比目测的层析图谱更为客观准确，具有较好的指纹鉴别意义。乔春峰等对闭鞘姜、莴笋花和光叶闭鞘姜根茎做了生药性状、组织显微和薄层色谱鉴别，通过薄层色谱定性，表明闭鞘姜和莴笋花均含有薯蓣皂苷元，而光叶闭鞘姜根茎则不含，为该类药材的鉴别和质量标准提供了依据。张雪荣对1年生白芍(断面直径在0．5 cm以下)、2年生白芍(断面直径在0．5—1 cm)、3年生白芍(断面直径多在l cem以上)用50％乙醇及超声波处理后，取其上清液作为供试液，置高效薄层硅胶G板上展开，用GS一930型薄层扫描仪在可见光区对层析显色后的斑点进行光谱扫描测定，结果白芍芍药苷含量(％)(n=3)分别为l．04，2．21，3．57；1年生白芍芍药苷含量还不到3年生的l／3，提示在收获白芍时一定要除去细小侧根及须根，以提高生药质量。岳瑞等以正丁醇一无水乙醇一冰醋酸一水(8：2：2：3)为展开剂，于λs=500nm，λR=670 nm处对购自不同药店的天花粉进行薄层扫描测定，结果瓜氨酸点样量的线性范围为0．245．1．960μg，平均回收率为99．4％，RSD为4．6％，且不同进货渠道的天花粉在瓜氨酸含量上有一定差异，认为该法可为天花粉药材及其制剂质量的进一步研究奠定基础。对于中成药，杨莉娅等将巴布剂复方紫荆消伤膏中的紫荆皮、马钱子、独活、白芷按规定制成样品液，分别点于同一含羧甲基纤维素钠(cMC—Na)的硅胶GF254薄层板上，用薄层色谱扫描法对方中士的宁含量进行测定。笔者认为此法简便，重现性好，可有效地控制大复方产品的质量。 2)高效液相色谱(HPLC)指纹图谱：HPLC由于具有分离效能高、分析速度快等优点，已广泛用于中药的定量分析，在中药的定性鉴别中亦能发挥很好的作用。李更生等对不同产地的地黄进行HPLC分析。结果表明，河南产地黄中梓醇含量较高，山东嘉祥产地黄梓醇含量较低。这说明河南产地黄作为道地药材有一定物质基础。游松等以芦丁为内标物，运用HPLC法对银杏叶化学成分进行分析，从银杏叶药材、中间体及其注射剂中间体12批样品中得到20个共有锋，通过对各峰的相对保留时间和峰面积百分比进行比较，发现银杏叶药材、中间体及其注射剂的图谱有较好的相关性，12批样品非共有峰峰面积比均小于5％，该结果有助于银杏叶药材的标准化种植及其制剂的质量控制。方晓明采用HPLC法测定复方天麻胶囊中天麻素的含量，选择D101型大孔吸附树脂柱对样品进行前处理，用甲醇一1％冰醋酸溶液(3：97)为流动相，结果天麻素平均含量为5．8l mg／g，平均回收率为96．62％，RSD为1．20％，且稳定性好，可作为复方天麻胶囊的主要质量控制指标。崔秀明等采用HPLC法对三七、人参、西洋参、姜状三七、三七等的不同部位以及2种三七混淆品温郁金、白及做了指纹图谱分析，结果显示三七、人参、西洋参和姜状三七的HPLC指纹图谱差异较大，温郁金和白及在相应的色谱位置上没有皂苷峰出现，因而可作为三七鉴别和质量控制的方法。曹现峰等为了探索复方中药的主要有效部分群，试图建立一个可将黄连解毒汤中三大有效成分(生物碱类、黄酮类和环烯醚萜类)的主要成分分开并表现出来的HPLC指纹图谱测定条件，他们采用二元或三元梯度供液、CI8V反相色谱柱对黄连解毒汤进行测定，结果各峰分离度较好，基线平稳，说明该法的确可将上述三大有效成分的主要成分分离并表现出来。 3)气相色谱(GC)指纹图谱：GC具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快等优点。刘杰等对开胃消食口服液中乙酸龙脑酯进行GC分析，结果乙酸龙脑酯及内标物萘都得到很好分离，表明GC法可作为开胃消食口服液及砂仁药材中乙酸龙脑酯的含量测定方法。杨光明等采用气质联用分析技术对川芎不同溶剂提取物进行分析，并与同属植物当归比较，结果川芎以乙醚作为提取溶剂杂质较少，其提取物在14-22 min(RT)之间均有一段峰群，保留时间分别为17．95，18．40，18．84，19．52，19．63，19．87 min，这一峰群保持着相似的峰高比例，而同属植物当归则与之不同，且在18．12 min时当归比川芎多一个峰，在18．55，18．84 min时没有出峰，川芎在19．52，19．63 min的明显峰在当归图谱中也没有明显的特征性，因而可作为川芎的气相指纹图谱。刘桂霞等对冰硼含片中冰片的含量进行测定，结果冰片平均含量为0．847，回收率为99．90％，RSD为1．98％，认为该法可作为冰硼含片中冰片含量的定量方法，也为其他含冰片中药制剂的冰片含量测定提供了参考。 4)高效毛细管电脉(HPCE)指纹图谱：HPCE技术在药材鉴定中的应用是近年发展起来的方法。侯连兵等从三七及其混淆品菊叶三七的3种提取液(酸性、碱性、中性)图谱中，发现三七及其混淆品的HPCE图谱存在明显差异，图谱方法克服了药材外观、显微、粉末、理化等鉴别方法专属性不强的缺点，可作为在三七的鉴别方法。张朝晖等对12种不同来源、不同产地的海龙、海马类药材采用HPCE法进行鉴别，结果种间区别明显，重现性好，不同产地、不同贮存时间的同种药材的电泳图基本一致。赵新峰等ml采用HPCE法在检测波长210 nm、重力进样(10 cm×5 s)、30 mol／L硼砂溶液(pH=9．4)条件下，对山药进行尿囊素含量测定，结果精密度良好，平均回收率为101．8％，RSD为2．4％(n=5)。 5)紫外光谱(uV)指纹图谱：由于不同中药所含成分的不饱和程度有差异，因而其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异。陈伟君等将UV法用于蒺藜与混淆品软蒺藜的鉴别，效果良好，他们对蒺藜及软蒺藜用无水乙醇提取，以无水乙醇作空白，结果蒺藜在204．6，233．4 nm波长处有最大吸收，而软蒺藜则在203．8 nm波长处有最大吸收。因此，利用这一点可达到鉴别的目的。蒋伟哲等为了考察广西各产地猫豆的品质，用UV法对采自宜州、东兰等地的猫豆进行左旋多巴含量测定，结果猫豆种肉中左旋多巴含量以东兰产的最高(为9．35％)，最低的产自田东(为6．99％)；种皮中左旋多巴含量最高的产自田东(为0．43％)，最低的产自百色(为0．29％)。提示石山地区猫豆品质最佳，更适合发展猫豆种植业，这对于解决我国目前I临床所用左旋多巴主要依靠进口，国内产品价格较高的问题具有重要意义。刘桂明等利用紫外及一阶导数对茵陈及其混伪品碱蒿、莳萝蒿、野艾等进行鉴别，结果发现，样品的零阶紫外光谱差异较小，而一阶导数光谱差异明显。 6)RAPD技术：现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源，即“物种”的多样性是其基因多态性的结果，RAPD技术可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性，为观察个体或群体的变异，揭示“道地”药材的“地道”之本质提供线索。任冰如等用RAPD法对苍术不同居群间的亲缘关系进行分析，选取10种10碱基随机引物，对苍术10个居群的83个个体进行扩增，共获得100个DNA片段，其中65个片段为多态的(占65％)，根据扩增结果进行统计分析，分析结果表明，苍术10个居群可划分为大别山、南苍术、北苍术3个类群，并且南、北苍术类群之间遗传距离较近，而大别山类群与前二者的遗传距离较远。陈林姣等采用RAPD技术对中药溪黄草类4种原植物进行研究，对每个品种各取10株植物的幼嫩叶片，混合提取总DNA，对76个10mer一寡核苷酸引物进行PCR扩增，共筛选出14个扩增产物重复性好的引物，14个有效引物共检出194个位点，其中品种特有位点108个(占56．6％，品种特有位点可作为区别不同种的遗传标记)。结果表明，溪黄草扩增出的6条带，其他种均与之不同；线纹香茶菜在1 167，638 bp处各有1条特异性带；细花线纹香茶菜较狭基线纹香茶菜多l条920 bp带；不同产地的狭基线纹香茶菜的扩增产物完全一致。因此，采用这种技术，能取得较好的鉴定结果。梁之桃等提取了柴胡属5种植物总DNA，以OPD一1，OPD一8，OPD—11这3个随机引物进行非特异扩增，结果3个有效引物共扩增了54个DNA片段，其中公共片段3个，多态性片段51个，占94．4％；通过对RAPD扩增片段进行统计分析，建立了种系发生图，显示种内遗传变异比种间遗传变异小，可作为柴胡属植物鉴定和分类的依据。黄芸等对射干类药材及其混淆品鸢尾属植物鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等5种药用植物进行分子水平鉴定，结果用OPD一8可以将4种鸢尾属植物混淆品完全区分开，且任意两个样本间的遗传距离指数显示，射干与野鸢尾间的亲源关系较近，野鸢尾与鸢尾的亲源关系较远。 7)1HNMR指纹法：1HNMR指纹法是一种新的植物中药鉴定方法，有单一性、全面性、定量性和易辨性4个特点。赵天增等通过对25类不同科属36种植物中药的152个不同来源样品及部分中药伪品进行考察，证实同种植物中药特征总提取物A和B的~HNMR指纹图有很好的重复性和高度的特征性，可以用来鉴别植物中药的品种；根据1HNMR指纹图谱，可对同科不同属植物进行属间和种间的区分。他们还认为，要使植物中药的IHNMR指纹图谱便于使用、推广、普及和更加科学化，必须对其进行规范。如建立60 MHz和超导两种磁场条件下的~HNMR指纹图；选择1个分辨率最好、最具有代表性的最佳图谱作为相对标准1HNMR指纹图进行绘制，并标出具代表意义的共振峰，多个共振峰在一起分辨不清楚时，图谱要拉宽；在相对标准~HNMR指纹图下面要有~HNMR数据表，列出所有具有代表意义的共振峰数据；为了便于辨认~HNMR指纹图，已鉴定的化学成分结构式及其名称均要标出。 4 中药指纹图谱的局限性 4．1 由于中药成分复杂，已知的化学成分不能完全代表该药的全部疗效，用这些成分作为参比标准，其与药理作用之间的相关性不明确，人们无法从指纹图谱中解析某一峰或某一段峰所代表的药理作用，而使用色谱分析法获得的指纹图谱常常将未达到基线分离的色谱峰作为特征峰，因此无法检验这些峰的纯度，也不能确定某一组分对该峰的贡献，也就是说样品的指纹图谱与标准指纹图谱相符有时并不能表示样品与标准品相符。 4．2 中药样本的取样受中药所属科种属、产地、采收季节、贮存条件、地道药材与非地道药材的差异、炮制品、掺伪现象等因素影响，这给指纹图谱分析带来了一定困难。 4．3 对色谱图的判定，仍须人工处理数据与图谱，人为的主观误差，很可能会导致不同的判断。 4．4 制备指纹图谱必须设立参照物，如果该中药化学成分不明确，则无法建立能确认该中药的指纹图谱。 4．5 建立在化学成分模糊不清基础上的中药指纹图谱质量控制方法只能是一种过渡性质量控制方法，其本身有许多需要完善的地方，但它在区分中药材方面，甚至是不同产地的药材鉴定方面有着显著的优点，这对目前中药材的鉴定和分类在很大程度上还依赖于经验和表观分析意义重大。通过指纹图谱分析，既可以避免有毒植物误用，又有利于发现新种。而要建立不同品种中药材的标准指纹图谱库是一项繁重而细致的工作，需要国家政策调整、企业和科研单位协作攻关，广大中药工作人员任重而道远。

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