内生真菌在中药中的应用前景

内生真菌(Endophytes)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，包括那些在其生活史中的某一阶段营表生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌(内生真菌的定义目前尚有争议，本文暂采用这一广义定义)。国外学者对内生真菌的关注开始于1 9世纪末，牲畜食用了含有内生真菌的牧草而中毒的事件。1993年，Strobel等从短叶红豆杉Taxus brevifalia Nutt的韧皮部中分离出一株能产生紫杉醇的内生真菌Taxomycesandreanae，引起了国内外学者的极大兴趣。研究发现，植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的化学成分。植物内生真菌由于生活在植物体这一特殊的环境中，长期与植物相互作用，产生了特殊的化学物质，有利于植物生长。研究得较多的是提高植物的抗逆性及产生一些具有抗癌、抗真菌等有潜在应用价值的代谢产物。在目前统计的1 2 807种中药中，植物药有11 1／16种(约占87％)，如此众多的植物种类将成为内生真菌的资源库。本文将从内生真菌的多样性、生物作用等方面简要介绍植物内生真菌在中药中的应用前景。 1 内生真菌的多样性 从目前已研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断内生真菌在植物体内是广泛存在的。内生真菌主要是由子囊菌及其无性型组成，也包括担子菌和接合菌Ⅲl-。内生真菌由于植物种类、植物生活的环境、取样量及操作人员的技术等因素的不同在数量上从几十种到上百种不等。对内生真菌与宿主专一性分析表明，平均每种宿主有4～5种专性内生真菌，按全球目前已知25万种植物计算，内生真菌总数可以超过l0O万种。李治滢等从灯盏细辛的根、茎、叶、花中分得54株真菌，分属5目，7科，22属。项勇等仅从东北红豆杉Tasxuscuspidata Siebet Zucc．树皮中就分离出21株内生真菌，其中1种属于子囊菌，另外20种分属半知菌中的链格孢属、葡萄孢属、散囊菌属、曲霉属等20属，种属多样性极为丰富。毫无疑问，内生真菌在其它中药的原植物内一样具有广泛的种属分布和数量优势。内生真菌在种类和数量上的极其丰富的多样性将成为宝贵的真菌资源库，为从中发现新菌种和筛选有活性的代谢产物提供广泛的研究空间。 2 内生真菌对植物生长的促进作用 内生真菌生活在植物体这一特殊的环境中，构成了植物体内的微生态系统，与宿主协同进化，形成了互惠共生的关系。它在吸收植物为自已提供的营养的同时，又对植物的生长发育和系统演化起着重要作用。 很多学者在对禾本科植物(尤其是牧草、草坪草等)内生真菌进行系统研究后发现，内生真菌的存在能促进植物的生长发育，表现在增加植物的总生物量和分离数以及单株花序数量和种子数量，提高植物种子的饱满率和发芽率等方面。在其它植物内生真菌的研究中同样得到了其内生菌促进植物生长的结论。肖盛元等从内生真菌中筛选出一种对濒危中药金线莲生长有明显促进作用的粘帚霉属真菌。高微微等也发现开唇兰小菇、石斛小菇和兰小菇3种内生真菌菌丝及代谢物的提取对铁皮石!斛和金线莲的生长有显著促进作用。张集慧等选取了对促进天麻、石斛兰科药用植物生长发育效果较好的5种内生真菌作为研究对象，从其发酵液和菌丝体中检测出了不同含量的植物激素，较好地解释了内生真菌促进植物生长的机制。内生真菌对植物的这一促进作用提示我们可将相应内生真菌接种于特殊的药用植物，比如生长缓慢、自然繁殖困难(兰科药用植物)、濒危药用植物等，促进植物生长，提高中药材产量。笔者认为具有促进植物生长作用的内生真菌有一定的宿主专一性，故接种时须考虑植物排异反应，可从同种异地或异种同地或同属(或亲缘关系较近的)植物中筛选目的菌株，以减小排异反应。 3 内生真菌产生具潜在价值的代谢产物 具有产紫杉醇活性的内生真菌被Strobel等分离并报道后，人们纷纷把目光投向了内生真菌的代谢产物的研究开发方面。关注得较多的是抗癌植物的内生真菌，大量的研究中也筛选出具有一定抑菌活性的内生真菌。在对药用植物的相关研究中还发现了内生真菌的特殊作用。 3．1 产生与宿主相同或相似的化学物质基于内生真菌能够产生与宿主相同或相似化学成分这一观点，人们从具有抗癌活性的植物人手，进行了内生真菌代谢产物的分析并得到了很有价值的成果。目前从内生真菌代谢产物中筛选出的抗癌物质有紫杉醇类、鬼臼毒素、长春新碱、球毛壳甲素等。有学者先后从云南红豆杉Ta-rus yunnanensis、西藏红豆杉T。zoallachiana、中国红豆杉丁．ckinesis等植物中分离出产紫杉醇或其类似物的内生真菌。云南大学张玲琪等分别从桃儿七Sinopodphyllnm emodii、中华山荷叶Diphylleia sine?ISIS Li等产鬼臼毒素的植物中分离出不同种属的能够产生鬼臼毒素的内生真菌；从长春花Catharanthus roseus(L)G．Don茎中分离出一株能产长春新碱的尖孢镰刀菌，美登木中分离出一株球毛壳菌，它产生的球毛壳甲素是与宿主所产生的美登素不同的抗癌物质。学者们已将视野拓展到抗肿瘤植物以外，王梅霞等从银杏Ginkgo bilobaL．叶片中分离获得了一株产生黄酮类化合物的内生真菌刺盘孢Collettrichurn sp．由于微生物具有易进行工业化生产；易诱变提高有效产物的含量；发酵产物较植物成分单一，有效成分容易分离等优势。将从内生真菌中提取单体代替以前的从植物中提取单体，可解决许多中药作为资源植物而被大量采伐引起的资源和生态危机，对濒危药用植物的资源保护也起到了积极作用。可见在数量众多的中药中寻找能够产生与宿主具有相同和相似成分或具有相似药理作用成分的内生真菌具有深远意义。 3．2产生具抑菌活性的物质在很多对植物内生真菌的系统研究中，均发现内生真菌的代谢产物有抑菌作用，有的对病原微生物有很强的抗性。李桂林等从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离出1 72株内生真菌中有90株对植物病原真菌，如红色面孢霉、木霉、镰刀菌、轮枝孢霉等病原真菌中的一种或多种有抑制作用。 Strobe G等从雷公藤Tripterigeum wil fordii的茎中分离到一株能产生Cryptocandin的内生真菌，它不但能抑制菌核病菌和灰葡萄孢等植物致病真菌，而且还能有效抑制白假丝酵母和人类病原真菌Trichophyton sp。数量众多的内生真菌将成为筛选新型抗生素的资源库，其筛选成功率比从放线菌筛选大得多，而将中药本身的抗菌作用作为指导可能会使我们的筛选工作事半功倍。内生真菌对植物病原真菌的抑制作用也使我们看到了内生真菌作为生物防治剂的应用前景，这将为中药农药残留问题的解决提供好的思路和方法。已有学者有目的地将外源内生真菌导入未感染植株，获得作为生物农药的内生真菌，发挥其生物防治作用。 3．3促进宿主某些代谢产物的形成和生长内生真菌在与植物协同进化的过程中，不但自身能够产生特殊的化学物质，还能诱导宿主植物某些代谢产物的形成和生长，在药用植物中的表现尤其明显。江东福等将从柬埔寨龙血树Dracaena cochinchinensis茎干中分离到的内生真菌接种于活体龙血树，发现其中的4种镰刀菌对血竭的形成有重要作用，可使血竭的形成量提高66％ 120％；接种于死态龙血树同样可促进血脂的形成和积累。由此可见，将植物内生真菌接种于特殊中药(一般选取与微生物关系密切的中药)，可以提高中药有效成分含量和产量，克服传统中药有效成分含量低的问题和资源不足的限制，是传统中药生产向高质量、高产量的现代中药生产发展的新途径。 王剑文等发现在黄花蒿Artemisia annua L．发根液体培养中，黄花蒿内生炭疽菌Colletotrichum sp．细胞壁寡糖提取物可促进青蒿素的合成。有学者进行了促进紫杉醇合成的真菌诱导物的研究，筛选出有效诱导紫杉醇的真菌F5为菌种，比较了小同制备方法和与它药的组合方式对紫杉醇产量影响。大多数中药的活性成分群多为植物抗毒素，真菌产生的寡聚糖对植物防御系统的刺激可促进植物抗毒素的产生，所以外源性的刺激常可以使植物某些次生代谢物产量增加，从而可以获得宝贵的天然药物。内生真菌由于与植物长期共同生活，其致病力较低。因此，内生真菌将是提高中药药效成分含量的最佳外来刺激源。 4问题与展望 内生真菌是微生物研究中的一个热点，已经引起了很多学哲的极大兴趣和热切关注，尽管人们在植物内生真菌的种类、生态分布、其代谢产物的活性等方面做了大量的工作，但有关植物内生真菌仍存在众多的问题有待人们去解决。 4．1 植物中内生真菌在人工培养基上无法完全分离出。另外，虽然在培养基中加入了抑制真菌疯长的物质．一些生长快的真菌还是会掩盖生长慢的真菌。同时很多内生真菌离开了植物体就不产生孢子，给真菌鉴定带来了困难且无孢类群容易因菌丝死亡造成菌种丢失。 4．2 目前对常用和大宗中药内牛真菌的研究较少，活性菌株的筛选模型单一，通常采用TLC检识和抗肿瘤、抗菌筛选，没有体现中药研究的特点，极大地限制了对有效物质的发现。因此，建议在中药内生真菌的研究中，充分利用中约长期的临床实践经验和中药现有的药理药化研究成果，建立一些能体现中药特点的快速筛选模型，以期开发出部分中药的替代品。 4．3 内生真菌所产活性代谢产物的含量极低。同时内生真菌在多次传代后，生物特性退化，其代谢产物不稳定。 内生真菌在国内的研究才刚刚起步，所研究过的植物不过数百种，相对于自然界的25万种植物是微不足道的，这是一个极具发展潜力的研究领域。对中药中的内生真菌进行系统研究，充分利用微生物和中药的优势将会使我们在中药资源保护、中药材产量及中药有效成分含量的提高、中药农残问题的解决及新药开发等方面收益颇丰，必将推动中药现代化的进程。 致谢：本文在写作过程中承蒙云南省微生物研究所王兴红老师的悉心指导，在此表示衷心的感谢。

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