马兜铃酸毒性作用的研究进展

近十几年来，中草药所导致的毒性反应日益引起了人们的关注，其中较为典型的就是对马兜铃酸肾毒性作用的研究。上世纪90年代初期比利时学者Vanherweghem报道，部分女性服用了含有中草药成分(广防己等)的减肥药后，出现慢性肾功能衰竭(CRF)，病理学表现为弥漫性肾间质纤维化，出现低分子蛋白尿、严重贫血，以及在1-2年内发展为肾衰竭的终末期，即使停止用药也难以恢复。由于这种病与中草药有关，因而最初被称为“中草药肾病” (Chinese herb nephropathy，CHN)。自Vanherweghem报道至1998年，在比利时有100名以上的“中草药肾病”患者，其中至少已有70名患者接受了透析或肾移植治疗；日本、美国、加拿大等国家也先后报道了不少类似病例。但在随后的研究中表明，只有马兜铃酸 (afistolochic acid，AA)才是引起所谓“中草药肾病”的毒性物质，因而国内学者认为“马兜铃酸肾病”(afistolochic acid nephropathy． AAN)才是更为合理的命名，此命名也逐渐得到了国内外学者的广泛认同。笔者现就马兜铃酸毒性作用的相关研究进展作一综述。 1 马兜铃酸简述 1．1 化学结构 迄今为止，从马兜铃属植物中得到并鉴定的化学成分有140多种，主要包括马兜铃酸及其衍生物、生物碱、萜类及甾体化合物、黄酮类、苯丙素等。其中，引起AAN的化学成分主要是马兜铃酸和马兜铃酰胺。马兜铃酸是硝基菲羧酸，主要含马兜铃酸I(AAI)和马兜铃酸II(AAII)，大鼠或小鼠口服AAI和AAⅡ后体内主要代谢产物为马兜铃内酰胺I(AL I)和马兜铃内酰胺Ⅱ(ALⅡ)。 1．2 植物来源 引起AAN的中药，主要以马兜铃科马兜铃属植物为主。全世界有350多种马兜铃属植物，我国约有39种，主要有关木通、马兜铃、广防已、天仙藤、青木香、朱砂莲等，以关木通、广防己引起的中毒最为多见。 1 3 有关中药制剂 含马兜铃酸的中药制剂主要有龙胆泻肝丸(汤)、导赤丸(散)、妇科分清丸、八正丸(合剂、散剂)、耳聋丸、排石冲剂(排石汤)、甘露消毒丹、跌打丸、纯阳正气丸、大黄清胃丸、当归四逆丸、冠心苏合胶囊、辛夷丸、十香返生丸、清血内消丸等，其中在临床中以服用龙胆泻肝丸(汤)、排石冲剂和妇科分清丸等引起AAN的报道较多。 2 马兜铃酸的毒性作用研究 2. 1 肾毒性研究 2．1．1 动物实验 雌、雄大鼠口服AA的半数致死量(LD50)分别为183．9 mg／kg和203．4 mg／kg,静脉注射的LD50分别为74．O mg／kg和82．5 mg／kg。雌、雄小鼠口服AA的LD50分别为106．1 mg／kg和55．9 mg／kg．静脉注射的LD50分别为70．1 mg／kg和38．4 mg／kg。动物组织病理学特征表现为胃贲门浅表性溃疡，肾小管坏死，淋巴器官萎缩。 裘奇等给大鼠以关木通60 g／(kg·d)灌胃，连续3 d及5 d，可引起大鼠急性。肾功能衰竭(肾功能异常包括氮质血症、近端及远端。肾小管功能障碍)，组织形态学呈急性肾小管坏死，病变部位主要在皮髓交界处。李恒等以关木通中提取的AAI给大鼠连续灌胃3 d，剂量分别为50，100，200 mg／kg，造成的急性肾功能异常和肾脏组织形态学病变特征与关木通引起的变化相似，因此认为， AAI是关木通中主要的毒性成分。 国内有学者以AA纯品，5 mg／(kg·d)给雌性Wistar大鼠腹腔注射16周，观察至24周，可见实验组大鼠出现肾脏寡细胞性纤维化和慢性肾功能衰竭，与临床所观察的慢性AAN极为相似。 Cosyns等给新西兰兔腹腔注射AA 0．1 mg／(kg·d)，每周5 d，连续观察17~21月，动物出现肾间质纤维化、近端肾小管上皮扁平等。上述实验应用AA成功地建立了与临床相似的动物模型，发现AA的剂量及给药时间长短的变化是慢性AAN动物模型制作成功与否的关键，进一步论证了AA是引起肾损害的主要毒性成分，为深入了解AAN的发生机制奠定了基础。 李恒等发现，对大鼠静脉给药AAI 1．0，5．0，25．0 mg／kg后，短期内AAI能减少肾血管阻力值，增加。肾血浆流量、肾小球滤过率和尿量，但不具有引起肾组织一过性缺血从而加重肾组织损伤的能力。刘志红等发现，AAI致大鼠急性肾损伤远期效应的特点，是大鼠肾功能和肾脏组织病理学改变可逐渐恢复，肾小管间质无明显炎细胞浸润和纤维化等慢性病变。左巍等发现，马兜铃可导致大鼠非少尿性肾脏损伤，AAN大鼠贫血发生较早，存在炎性细胞浸润，病理改变早期主要为。肾小管上皮细胞变性、坏死。晚期则肾小管萎缩、问质纤维化。采用甲苯胺蓝特殊染色法及纤溶酶单克隆抗体(tryptase mAb)对AAN大鼠进行研究，结果证明AAN的发展过程中，其肾间质中存在肥大细胞，说明肥大细胞可能与AAN的发生发展密切相关。 2．1．2 体外实验 AA可引起肾小管上皮细胞转分化、凋亡或坏死。目前认为，肾小管上皮细胞转分化很可能是肾问质纤维化的主要机制之一。 高瑞通等报道，在体外条件下，0．02，O．04，0．08g／L的AAI作用24 h，可明显诱导猪肾小管上皮细胞系(LLC-PKI)细胞凋亡，而0．01 g／L的AAI无此作用。凋亡细胞比例随AAI浓度的增高而增加，说明AAI诱导的细胞凋亡作用与浓度有关。同时，发现AAI所致LLC-PKl细胞凋亡的发生可能与[Ca2+]升高有关，拉西地平可能通过抑制[Ca2+]升高而抑制AAI所致的细胞凋亡。苏震等将不同浓度的AA(5，10，20，40 mg／L)分别加入人肾小管上皮细胞(HKC)细胞培养液中培养48 h，结果发现较低浓度 (10mg／L)的AA对HKC有轻度的促转分化作用，较高浓度(40mg／L)的AA作用48 h后可引起多数HCK凋亡，并有少量细胞坏死。张海洲等发现AA可诱导叙利亚仓鼠胚胎细胞形态学转化，抗氧化剂、维生素E可抑制AA的这一作用。 李恒等在体外实验中发现，AAI对HKC超微结构的影响以核变异为主，表现为核分叶、核畸形、小核、巨核、核仁缺失、核染色质深染、核膜高度卷曲增生等，在高浓度时偶见线粒体肿胀等膜性结构改变。李瑛等通过单细胞凝胶电泳实验发现，AAI浓度为160，320，640，1 280 ng／mL时能导致LLC-PKI细胞产生彗星拖尾现象，且剂量越大，拖尾越明显，证明AAI可导致LLC-PKI细胞DNA损伤，使细胞周期阻滞在G2／M期，这可能是马兜铃酸肾毒性损伤后肾小管上皮细胞再生修复能力差和形成泌尿道肿瘤的机制之一。AAI对LLC-PKl细胞DNA损伤和细胞周期阻滞作用是非p53依赖的。 近年，国内学者对AA诱导。肾小管上皮细胞转分化的机制、AA和某些生长因子在转分化中的协同作用进行了研究。文晓彦等通过体外实验发现，一定浓度(10，20μg／L)的AAl可刺激HKC分泌转化生长因子β1(1GFpl)，高浓度(40，80μg／L)AAI抑制HKC分泌TGFBl，因此认为，AAI诱导HKC转分化可能部分与TGFβ1分泌增多有关。他们又发现，一定浓度的单个核细胞趋化蛋白一1 (MCP-1)、AAI均可诱导HKC转分化，但作用都较弱，而当培养液中l司时加入MCP-1(0．1μg／L)和AAI(5，10，20，40μg／L)时，则表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的HKC细胞百分率比单独应用MCP-1或单独应用AAI时有显著增高，表明一定浓度的MCP-1和AAI对HKC的转分化有明显协同作用。唐功耀等报道，80μg／mL和160μg／mLAA对人肾小管上皮细胞株(HK-2)有明显细胞毒作用，此作用可能与急性马兜铃酸。肾病发病有关，而40μg／mL AA可上调HK-2及人肾间质成纤维细胞(hRIFs)的TGF-β纤溶酶原激活物抑制物l(PAI-1)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的mRNA表达，并能上调hRIFs细胞I型胶原(coll)的mRNA表达，此作用可能与慢性马兜铃酸。肾病发病有关。李彪等报道，AAI导致肾小管上皮细胞凋亡和纤连蛋白(FN)分泌的作用可能是由TGF-β1介导。尽管ALI与AAI同样具有导致细胞凋亡和细胞外基质成分分泌的作用，但ALI可能通过非TGF-βl机制而发挥作用。 2．1．3 临床研究 临床研究证实，AAN是一类主要表现为肾小管间质损害的特殊类型肾病。一方面，该类患者有明确服用含有AA的药物史，临床过程和病理变化与其他药物损害导致的急性肾小管坏死、急性问质性肾炎有明显的区别；另一方面，其病理变化与AAN动物模型相一致。 1999年尹广等回顾性分析了木通致肾脏损害患者的临床表现、肾活检结果及转归，发现3例患者在服用l剂木通(分别为30 g，10 g，50 g)后均出现非少尿性急性肾衰，随后出现肾功能减退。陈文等对58例AAN进行了分析，并根据其临床、病理表现特点，将AAN分为3个类型，即急性型、肾小管功能障碍型及慢性型。李晓玫等回顾性分析了1997-2001年共51例服用木通及相关中成药致肾小管问质肾病病例的临床及病理资料，结果表明，该类患者以乏力、消化道症状、多尿及夜尿增多为主要临床症状，常有明显肾小管功能障碍，伴肾小球功能异常，特征为无明显尿镜检异常及病变早期无贫血，主要病理特点为急性期肾小管上皮细胞严重变性、坏死、脱落，形成裸基底膜，细胞再生差，肾间质少有细胞浸润，纤维化病变出现早；慢性期肾小管逐渐萎缩，肾间质弥漫纤维化。患者血肌酐升高，并与贫血及肾间质纤维化程度密切相关。停药后多数患者在2个月内病情可稳定。陈楠等对7例AAN患者的病理特点进行了分析，发现长期服用含AA的中药可导致慢性肾功能衰竭，临床以肾小管损伤为主，表现为肾小管性酸中毒、肾小管性蛋白尿、肾性糖尿等，肾脏病理表现为少细胞性间质纤维化。最近，胡伟新等又总结了20例木通中毒患者的临床和病理特征，发现肾小管间质损伤程度与木通剂量、服药时间和病程密切相关。在台湾，有人收集了1994-1998年快速进展性肾功能衰竭的20例台湾患者的资料，发现他们除了曾服用过中草药，既往均没有肾脏病病史，肾活检结果和临床表现与所报道的AAN极为相似。陈文等研究发现，慢性马兜铃酸肾病患者的肾小管上皮细胞可转分化为肌成纤维细胞参与肾问质纤维化，而这细胞转分化很可能与其自身的高表达TGF—β1相关。 2．2 马兜铃酸的致癌性研究 20世纪60年代，对马兜铃酸的动物实验研究结果显示，其有抗肿瘤活性，能增强机体白细胞的吞噬作用，但随着对马兜铃酸的进一步研究及其临床应用，发现其有较强的致突变和致癌等作用。 1996年Schmeiser等报道了马兜铃内酰胺与肾组织DNA的主要加合物7-(deoxy a denosine-N6-y1)-aris-tolactma I的分离和检测，进一步证明了AA与ras基因的关系，并将AA划为基因毒型致癌物。1999年Cosyns等发现，AAN患者泌尿道上皮p53表达过量，p53基因突变会使细胞增殖失去控制，因此p53基因可能也与AA诱导的肿瘤发生有关。裘奇等对木通致大鼠肿瘤作用进行了详细的研究，发现：①肿瘤的发生与木通剂量和观察时间有关，实验1个月、3个月时，组织形态学未见大鼠发生肿瘤或明显肿瘤样增生，6个月时，大鼠发生全身性肿瘤，。肾内外肿瘤的发生均呈剂量依赖性；②肿瘤发生年龄倾向于幼年，无性别差异；③肿瘤发生及生长速度快；④肿瘤具有多发性，。肾脏肿瘤发生率相对较高。组织学类型以肾脏间叶性肿瘤为主，分化成熟的肾脏问叶性肿瘤伴有vimentin，SMA，p53和PCNA的阳性表达。 3 结语 综上所述，AA的毒性作用主要是致肾小管上皮细胞DNA损伤、肾间质纤维化以及致肿瘤作用，可给患者带来不可逆的肾脏损害。对于马兜铃酸的毒性应以预防为主，必须慎用马兜铃属植物和含有马兜铃酸的中成药，严格掌握用药剂量和时间，避免超量或长期服用，防止误用或混用，同时应加强AA临床血药浓度的检测，开展临床药理学研究，对AAN进行科学的流程病学研究，以产量减少和避免AA毒性作用的发生。 摘自:《中国药业》文/高玉桥，钟希文，梅全喜

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