HPLC法测定感冒退热颗粒中腺苷的含量

       感冒退热颗粒由大青叶、板蓝根、连翘及拳参四味中药组成，是2005年《中国药典》收载品种。具有清热解毒、疏风解表的功效。用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽喉炎属外感风热、热毒壅盛症，症见发热、咽喉肿痛。药典标准中对本制剂是以测定方中连翘所含连翘苷的含量作为定量指标，但大青叶、板蓝根作为方中主药，决定了本方制剂的功效，大青叶、板蓝根主要化学成分有：吲哚类化合物、喹唑类化合物、有机酸类、碱基核苷类、氨基酸类等多种成分，其文献报道的定量分析方法多测定其所含靛蓝、靛玉红的含量，但在该制剂制备工艺中为水煎液提取，吲哚类化合物靛蓝、靛玉红为脂溶性，在水提液中溶解度小且不稳定而无法作为控制指标，故本文选择其中水溶性核苷成分-腺苷作为定量标准，通过高效液相色谱法测定腺苷含量，以求从多方面控制感冒退热颗粒的质量。
       1.仪器和试药
       1.1仪器  日本岛津高效液相色谱仪(LC-10ATVP、SPD-10AVP、CBM-102色谱工作站)，VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，梅特勒一托利多AB135-S电子天平。
       1.2试药腺苷对照品(879-200202，供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供)；感冒退热颗粒(批号061214，070121，070407，070516，070825，市售产品)；甲醇为色谱纯(天津市四友生物医学技术有限公司)；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。
       2.方法与结果
       2.1色谱条件  色谱柱为VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.5)[取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5mL与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5mL，混合(pH 6.5)]-甲醇(17：3)；流速为1.OmL•min-1；检测波长为260 mm；柱温为室温。理论板数按腺苷峰计算不低于2 000。
       2.2对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥12h的腺苷对照品9.82mg，置50mL容量瓶中，用15%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(浓度为196.4mg•L-1)
       2.3供试品溶液的制备取供试品，研细，精密称取0.5g，置50mL容量瓶中，加15%甲醇适量，超声处理30min取出放冷，加15%甲醇至刻度，用0.4μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
       2.4阴性溶液的制备  按处方比例称取除板蓝根外的其它药材，按感冒退热颗粒的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。
       2.5空白试验取对照品、供试品溶液及阴性溶液按上述色谱条件各进样20μL，测定，结果表明阴性无干扰。
       2.6线性关系考察  取已配制好的浓度为196.4mg•L-1的腺苷对照品溶液，分别精密吸取1、2、3、4、6、8、10mL，置50mL量瓶中，用15%乙醇溶液稀释至刻度，得腺苷对照品系列标准浓度的溶液，按上述色谱条件，分别进样20μL，测定峰面积，以峰面积积分值(Y)为纵坐标、腺苷浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=6 467X+982，r= O.9999(n=6)。结果表明腺苷在3.93～39.28 mg•L-1之间有良好的线性关系。
       2.7精密度试验  精密吸取腺苷对照品溶液20μL，在同一实验条件下，重复进样5次，测定峰面积，RSD=0.93%(n=5)，仪器精密度良好。
       2.8加样回收率试验取已知含量的供试品，平行6份，分别精密加入腺苷对照品适量，按供试品溶液的制备方法处理。测定腺苷含量，结果见表1，得平均加样回收率为99.3%，RSD=0.61%，(n=6)。
表1加样回收率试验结果(n=6)
样品中含量  对照品加入量  测得量  回收率  平均值   RSD
   /mg          /mg         /mg     /%      /%      /%
  0.225        0.2622      0.4838   98.7
  O.208        O.2622      O.4664   98.6   
  O.23l        O.3765      0.6037   99.0   99.3    O.61
  0.220        O.3765      O.5946   99.5
  O.230        O.4906      0.7207   100.0
  O.211        O.4906      0.7011   99.9
       2.9稳定性试验精密吸取依法制备的同一供试品溶液，在24h内每隔4 h重复进样，共7次，每次20μL，则在O，4，8，12，16，20，24h时，测定其峰面积。结果其峰面积的相对标准偏差RSD=0.96%(n=7)，表明供试液中腺苷在24 h内稳定。
       2.10重复性试验精密称取同一批号的样品(批号：070825)共5份，按含量测定项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，计算腺苷的含量分别为O.453 O、0.460 2、0.455 8、0.4538、0.4511 mg•g-1，RSD=0.76%。
       2.11样品测定取不同批号样品5份，按2、3项下方法制备样试液，依法测定，以外标法计算，结果见表2。
表2样品含量测定结果
    样品批号    腺苷含量/mg•g^-1   RSD/%
    061214       O.76             1.02
    070121       0.65             O.87
    070407       O.9l             O.81
    070516       0.73             0.98
    070825       O.45             0.76
      3.讨论
       3.1  在实验中比较了水、15%甲醇、50%甲醇及90%甲醇作为提取溶媒，结果采用15%甲醇作为提取溶媒效果最好。考察了超声处理10、20、30、40、60min，结果表明，30 min后腺苷含量基本不再改变。
       3.2根据文献，试用乙腈-水(6：94)、0.1%磷酸胺-甲醇(90：10)等作流动相，但结果总不理想，腺苷峰分离度不好，出现拖尾，而采用磷酸盐冲液(pH6.5)-甲醇(17：3)流动相，达到基线分离，效果满意。
       3.3通过对来自不同厂家不同批号的样品中腺苷的含量分析，其含量差别很大，有的甚至相差数倍。由此可见，通过对腺苷成分的测定，可反映出制剂投料中大青叶、板蓝根药材的质量问题，对其进行质量控制非常必要。

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