HPLC-ELSD法测定屏风生脉胶囊中黄芪甲苷的含量
屏风生脉胶囊由黄芪、白术、防风、五味子、人参、麦冬及附子等9味药材组方而成，具有益气，扶阳，固表功效。用于气短心悸，表虚自汗，乏力眩晕，易感风邪等症。本方中黄芪为主要药味，黄芪甲苷是黄芪的主要成分。本品收载于国家药品标准…，由于该标准制订和执行时间较早，它只有简单的鉴别项而没有含量测定项，不能有效地控制本品的药品质量。本试验用高效液相色谱-蒸发光散射检测法对屏风生脉胶囊中黄芪甲苷的含量进行测定，结果证明该法简便易行，重复性好，专属性强，可以用于屏风生脉胶囊产品质量的控制。
1.仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100 series高效液相色谱仪(DEGASSER，IsoPump，ALS，COLCOM，Chemstation for Lc 3D)；Alltech 2000型蒸发光散射检测器， HK250超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司250W，50KHz)，梅特勒一托利多AB265-S电子天平(德国)。
1.2试药黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号：1 10781.200613，含量测定用)；除甲醇为色谱纯、水为纯化水外，其它试剂和试药均为分析纯；屏风生脉胶囊为市购品(批号：0703021、0703041、0704061)，缺黄芪阴性对照品按屏风生脉胶囊缺黄芪的处方制成。
2.色谱条件
Agilent-ODS-3色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-水(37：63)；ELSD参数：漂移管温度为100℃，氮气流速为2.0mL•min-1，进样量为20μL；柱温：25℃，流速为1.0mL•min-1。
3.试验方法与结果
3.1 对照品贮备液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品19.85mg，置入20mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制成每1mL含黄芪甲苷0.992 5mg的溶液，即得。
3.2对照品溶液的制备精密吸取对照品贮备液3mL，置入5mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，制成每1mL含黄芪甲苷0.595 5mg的溶液，即得。
3.3供试品溶液的制备取本品20粒，研细混匀，取约4.0g，精密称定，置索氏提取器中，加入甲醇适量，加热回流提取6h，提取液回收甲醇至干，残渣加水25mL，微热使溶解，用乙醚轻摇洗涤2次，每次20mL，水溶液再用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40mL，正丁醇液回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4阴性对照溶液的制备照处方比例自行制备不含黄芪的阴性对照样品，然后同“3.3”项下的供试品溶液的制备方法进行制备，即得。
3.5系统适应性实验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图，黄芪甲苷与其它组分可完全分离，阴性对照溶液图谱在黄芪甲苷峰位置处无假阳性峰
3.6线性关系考察精密吸取对照品贮备液1.O、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置入5mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀。分别精密吸取20 txL注入液相色谱仪中，按上述色谱条件分别测定其峰面积，以黄芪甲苷的进样量的自然对数lnX(μg)为横坐标，峰面积的自然对数lnY为纵坐标，进行线性回归，其回归方程为：lnY=2.168 lnX+1.315 r=O.999 8(n=5)，结果表明黄芪甲苷在3.97～19.85μg•L-1
范围内与峰面积呈良好的线性关系。
3.7精密度试验精密吸取对照品溶液，连续进样5次，每次进样20μL，测定黄芪甲苷的峰面积，其峰面积的RSD=1.21%(n=5)，表明进样精密度良好。
3.8稳定性试验精密吸取供试品溶液20μL，分别在0、2、4、6、8、10、12h进样，按上述色谱条件测定，峰面积的RSD=1.36%(n=6)，结果表明供试品溶液在12h内基本稳定。
3.9重复性试验精密称取同一批号的屏风生脉胶囊样品，按“3.3”项下方法制备及上述色谱条件重复测定5次，测得黄芪甲苷的平均含量为0.31 mg•g-1，RSD=1.81%(n=5)。
3.10回收率试验采用加样回收法，分别精密称定已知含量(0.31 mg•g-1)的屏风生脉胶囊细粉2.0 g，共6份，分成三组(2份/组)，每组分别精密加入3、4、5 ml的黄芪甲苷对照品溶液(浓度为0.154 mg•mL-1)，按“3.3”项下方法制备及上述色谱条件测定含量，并计算回收率，结果见表1。
3.11样品含量测定 精密称取不同批号的样品4.0g(每批三份共9份)，按“3.3”项下方法制备，再精密吸取对照品溶液与样品溶液各20μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，以外标法测定样品中的黄芪甲苷的含量，结果见表2。
表1回收率试验结果(n=6)
|
编号 |
样品取样量/g |
样品中黄芪甲苷的量/mg |
黄芪甲苷的加入量/mg |
测得黄芪甲苷的总量/mg |
回收率/% |
平均回收率/% |
RSD/% |
|
1 |
2.0312 |
0.630 |
0.462 |
1.101 |
101.95 |
|
|
|
2 |
2.0155 |
0.625 |
0.462 |
1.071 |
96.54 |
|
|
|
3 |
2.0231 |
O.627 |
O.616 |
1.235 |
98.70 |
99.10 |
1.90 |
|
4 |
2.0056 |
0.622 |
0.616 |
1.235 |
99.5l |
|
|
|
5 |
2.0105 |
O.623 |
0.770 |
1.394 |
100.13 |
|
|
|
6 |
2.0148 |
O.625 |
O.770 |
1.378 |
97.79 |
|
| 批号 | 样品中黄芪甲苷的含量(mg.g-1 ) | 样品中黄芪甲苷的平均含量(mg.g-1) | RSD(%) |
|
|
0.317 |
|
|
|
0703021 |
0.305 |
O.31 |
1.93 |
|
|
0.311 |
|
|
|
|
O.292 |
|
|
|
0703041 |
O.296 |
O.29 |
2.10 |
|
|
0.248 |
|
|
|
|
0.317 |
|
|
|
0704061 |
0.313 |
O.31 |
1.78 |
4.讨论
4.1有关测定含黄芪的制剂中黄芪甲苷的含量方法较多，有采用薄层色谱.分光光度法、荧光分光光度法、薄层色谱扫描法和高效液相色谱法但主要有两种方法，一种是薄层色谱扫描法，还有一种是高效液相色谱法，前者为了排除其它成份的干扰须经过多步分离纯化，而且在纯化过程中黄芪甲苷的损失也较多；而使用后者的方法时要考虑到黄芪甲苷仅在200nm左右有弱的末端吸收，在用紫外检测器时要求操作条件十分严格，噪音对结果影响较大，
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