僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究

  僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori L．4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体，为传统中药，性味咸、辛、平，归肝、肺、胃经川。具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效，可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4]，其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用[5-7]，草酸铵和蛋白质(或多肽)、氨基酸等可能为其主要活性成分。为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分，本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化，及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析，现报道如下。

1  实验材料

  waters 515 HPLC系统(waters公司)；Bsl00A自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂)；Start一4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司)；4300-Pro紫外分光光度计(瑞士安玛西皿公司)；HR2838型匀浆机(菲力普公司)；LPll5 pH计(METTER TOLEDO公司)；DDS-II A电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪(0．1 f11L和1．0 mL，日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16和Z-2f层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司，批号N25006)；兔血浆(自制)；15种氨基酸对照品(sigma公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2一巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学试剂均为分析纯。

2方法与结果

2．1样品溶液的制备

    称取制僵蚕1 500 g(样品A)，用8倍量水浸泡过夜，以3000 r／min匀浆，然后煎煮2次，每次30 min，过滤，合并滤液，离心，得提取液8450 mL(样品B)，将其浓缩至含原药材2 g／mL，加无水乙醇浓度至60％，4℃放置过夜，3 000 r／min离心，取上清液水浴浓缩至含原药材约6 g／mL，即得粗提液240 IIlL(样品C)。将30 mL该液加到用0．05 mol／L NaCl的0．02 mol／L Tris-HCl(pH 7．4)缓冲液平衡的Sephadex G一25凝胶柱(φ2．6 cmX80 cm)上，用相同缓冲液洗脱，自动分步收集器收集，2．5 mL／(10 min·管)，每2～3管按文献方法测定凝血酶时间(TT。s)、紫外吸收光谱，用重量法测定质量百分浓度(m／v)、电导率仪测定溶液电导率，得洗脱曲线(见图1)。将TT在40～100 s之间的组分合并得洗脱液69 mL(样品D)，TT~100 s的组分合并得洗脱液82．5 IIlL(样品E)，E即为抗凝活性部位。

紫外吸收光谱法(uV)检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位，与uV法测得的G一25凝胶色谱峰值不重合，而按质量百分浓度(M／V)和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。

2．2抗凝活性部位的化学成分理化鉴别

2．2．1  茚三酮反应、pH值、电导率、AgN03／HN0反应和 CaCl ／HNO反应分别取B～E样品溶液进行理化测定，结果表明，僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致，提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性，活性部分电导很大，与AgN03产生白色沉淀，滴加HNO后沉淀部分溶解，马 CaClz产生沉淀，滴加HNOa沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。  

 2．2．2  紫外吸收光谱取各样品稀释适当后在200～400nm扫描. 

 样品B～E的uV光谱形状均不相同，表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质，特别是经过凝胶色谱纯化后，uv光谱变化较大。

 2．2．3样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析取样品E中 TT~600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φl.6 cmX50 cmj柱，用水洗脱盐，4．0 mL／(10 min·管)，自动分步收集器收集，测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性。

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