3，5一二硝基水杨酸比色法测定红毛五加中多糖的含量

红毛五加(Acanthopanax giraldi i Harms)是五加科五加属植物，主产于我国四川省。四川省的红毛五加资源丰富，蕴藏量大，每年春天采收茎枝后，翌年仍生长茂盛。红毛五加与其它五加科植物不同，药用部位为茎皮，这对野生植物资源的保护无疑是十分有益的。我国已故著名的生药学家楼之岑先生在《常用中药材品种整理和质量研究》一书中建议将红毛五加列为《中华人民共和国药典》品种，目前尚未实现，但研究工作在不断深入，近几年来对红毛五加的研究进展较快，取得许多成果。化学成分研究表明，红毛五加主含挥发油、皂苷类、木脂素类、核苷类、多糖类、氨基酸、有机酸及微量元素等多种活性成分。药理作用研究证实，其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗辐射、保肝、调节心脑血管及机体免疫功能作用等。红毛五加活性成分之一的多糖类对免疫调节作用、抗肿瘤及抗病毒作用尤为突出，并在临床得以证实。为有效地控制药材质量，一般选用苯酚一硫酸法或硫酸葸酮比色法进行总糖测定，因总糖中包括单糖和多糖，不能明确地表明其中的多糖含量。另外，硫酸具有较强的腐蚀性，给实验操作带来极大不便。本试验采用3，5一二硝基水杨酸比色法(DNs法)，以葡萄糖作为对照品，通过测定总糖及还原糖的含量，计算出多糖含量。席法灵敏、稳定、重复性好，适用于含多糖类中药的质量控制砑究。

1材料

1．1多糖的分离与提取

取红毛五加皮，经粉碎，过40目筛，称取500 g，加适量水湿润2 h，装入渗漉筒中，加水浸没药材，浸渍6 h后，开始渗漉。以5 mL／(min·kg)的漉速渗漉，收集8倍量的渗漉液，减压浓缩至相对密度1．04～1．06(室温)。加乙醇沉淀，使最终含醇量达70％，静置，分层后分离，取醇沉物进行真空干燥(60℃以下)得浅黄色红毛五加多糖提取物，经3批红毛五加多糖提取，其提取率分别为1．40％、1．20％、1．41％。

1．2仪器、试剂及药材

    uV一2550型紫外一可见分光光度计，SHIMADZU(日本)生产。

    无水葡萄糖(含量测定用，批号0833-9501)，中国药品生物制品检定所提供；3，5-----硝基水杨酸(DNs)试剂，上海润捷化学试剂有限公司产品；所用其它化学品试剂均系分析纯。

    DNS试液的配制：称取6．3 g DNS和262 mL 2 mol／L氢氧化钠溶液，加到500 mL含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中，7 d后使用。

红毛五加药材购自成都市，由中国中医科学院中药研究所谢宗万研究员鉴定为红毛五加茎皮。

2方法与结果

2．1溶液的制备

2．1．1  对照品浓溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，置50 IIlL容量瓶中(1 mg／mL)，加水定容至刻度，混匀，置4℃冰箱保存备用。2．1．2  对照品稀溶液的制备  分别取上述浓对照品液若干(1～5 IllL)置25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，备用。

2．1．3还原糖供试品溶液的制备精密称取本品约40 mg，置25 IIlL量瓶中，加适量水振摇，使其充分溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，备用。

2．1．4总糖供试品溶液的制备精密称取本品约40 mg，置50 mL磨口三角瓶中，加盐酸(1—2)10 IIlL，置沸水浴中10 min，取出放冷后，加40％氢氧化钠溶液调pH至中性，移入50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，备用。

2．1．5  空白溶液的制备取蒸馏水，与对照品溶液同时同法处理即可。

2．2样品测定

精密量取上述对照品稀溶液、还原糖、总糖供试品溶液及空白溶液各2 IIlL，分别置lO IIlL容量瓶中，各加入DNS试液1．5 J11L，摇匀，置沸水浴中加热5 min，取出，立即放入冰水中，冷却30 min，加水至刻度，摇匀，照分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录vA]在520 nm波长处分别测定吸收度，计算总多糖的含量，即得。

2．3 DNS比色法试验条件的选择

2．3．1检测波长的选择  分光光度计经空白溶液校准后，

先后取上述对照品溶液、还原糖供试品及总糖供试品待测溶、液进行全波段(360～900 nm)扫描，结果经比较分析，考虑取干扰较少、测定稳定且灵敏度较高的520 nm作为测定波长为宜。

2．3．2称样量大小对测定还原糖及总糖的影响  参照“2．2一项测定，除称样量大小改变外，其它测定条件不变。结果表明，称样量取30～40 mg范围影响不大。称样量过大，造成溶解不好或水解不完全；称样量过小，吸光度过小，超出仪器最佳范围易造成测定不准确误差，称量最适宜范围为30～40 mg。

2．3．3总糖供试品溶液加酸水解时水浴加热时间考察参照“2．2”项样品测定法，总糖供试品溶液加酸水解水浴加热时间改变，其它条件不变情况下，观察对总糖含量测定的影响。结果表明，总糖供试品溶液制备过程中，加盐酸溶液(1—2)，在水浴中水解时间长短对测定有影响。时间过短水解不完全，时间过长则检出含量下降，拟选择10 min为宜。

2．4工作曲线的制备

精密量取对照品稀溶液1．0、2．O、3．0、4．0、5．0 IIlL。分别置25 ITlL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取以上系列对照品溶液各2 mL，分别置10 mL量瓶中，各加2~DNS试液1．5ml摇匀，置沸水浴中加热5 min，取出，立即放入冰水中，冷却30 min加水至刻度：以相应的溶液为空白，照分光光度法2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录VB]，在520 nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A=5．678 40C—O．229 23，相关系数R= O．999 2，说明在浓度46．6～233．0 mg／L范围内线性关系良好。

2．5精密度试验   

    取还原糖供试品溶液2 mL，依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0．24977、O．24994、0．250 03、0．24989、O．25017、0．250 21，平均为0．250 O，RSD=0．068％(N=6)，说明仪器性能良好，操作是精确的。

取总糖供试品溶液2 mL，依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0．55287、O．553 12、0．55296、0．55437、0．55455、0．55466，平均为O．5538，RSD=O．15％(N=6)，说明仪器性能良好，操作是精确的。

2．6稳定性试验

    取还原糖供试品溶液2 IIlL，按样品测定项下依法测定，间隔一定时间测定1次，共测O～4 h，测得吸收度值分别为0．249 77、0．251 10、O．24953、O．24806、0．24635、0．241 70、0．23691．平均为0．246 20，RSD=2．08％(力=7)，说明还原糖供试品溶液在4 h内是稳定的。

取总糖供试品溶液2 mL，按上法测定，测得吸收度值分别为0．552 87、0．571 17、0．573 49、0．575 59、O．565 75、 O．575 12、0．578 70，平均为0．570 38，RSD=1．53％(N=7)，说明总糖供试品溶液在4 h内是稳定的。

 2．7重复性试验   

    取同一批号样品5份，按还原糖供试品溶液制备方法制备；依法测定，计算还原糖含量分别为5．801％、6．048％、6．123％、6．003％、6．207％，还原糖平均含量为6．04％，RSD：2．53％(n=5)。说明本方法重复性好。

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