液体振荡培养八角莲愈伤组织及其鬼臼毒素的含量测定
八角莲Dysosma vers咖ellis(Hance．)M．Cheng．来源于小檗科八角莲属，属于国家三级保护濒危植物。其根茎入药，具有清热解毒、化痰散结、祛痛消肿功能，用于痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打损伤等症。现代医学中八角莲注射液用于治疗流行性乙型脑炎，流行性腮腺炎，并有明显的退热作用。化学研究表明，该属植物中含有鬼臼毒素类木脂素，具有较强的抗肿瘤活性，为抗癌药Vp-216的原料。
八角莲属植物零星分布于长江以南地区，喜生于腐殖质丰富的林下阴湿处或山沟石缝间，对生态环境要求较严格，生长缓慢，种子繁殖率较低。为加
强对该属植物资源的可持续利用提供技术支持，前期的研究中发现，以八角莲的叶片作为外植体，种在MS+NAAl．0 mg·L+2，4．D 2．0mg·L+6一BA O．5mg·L的培养基上，愈伤组织的诱率可达55％。
本试验进一步探讨了如何促进八角莲愈伤组在液体培养基中的生长，同时用HPLC测定了愈组织中次生代谢产物鬼臼毒素的含量，并初步研了添加前体物质苯丙氨酸对合成次生代谢产物的响。
1仪器、试剂与材料
振荡培养箱(HZQ-X100)，高效液相色谱 Agilent 1100 HPLC，二极管阵列(DAD)检测器。
鬼臼毒素对照品：购于中国药品生物制品检所。
八角莲植物样品：野生植株采于江西省井冈自然保护区。2方法与结果2．1八角莲愈伤组织的诱导培养 八角莲新鲜叶片用75％乙醇浸泡10 s，用无菌水冲洗一遍，再放人0．15％升汞溶液表面消毒10 min，无菌水冲洗三遍，切成约1 em2小块，接种到固体培养基MS+ NAA 1．0mg·L+2，4一D 2．0 mg·L+6-BA0．5 mg·L中，接种后置于培养室内日光灯下培养。光照度为700 1x，每天光照10 h，培养温度20±2cc。培养10 d后，逐渐形成愈伤组织，新生的组织结构松散，应及时取出转移至液体培养基中振荡培2．2液体培养基中不同激素配比对愈伤组织生长的影响固体培养基上诱导的愈伤组织生长20 d左右，组织松散，及时转移到激素配比不同的液体培养基(基本培养基均为MS)中。100 mL液体培养基《分装在250 mL的培养瓶中，每瓶接种愈伤组织
min～。培养20 d，过滤取出所有的愈伤组织，称重，计算平均重量。结果表明，在MS+NAA 0．2 mg。 L～+6-BA3．0 mg·L的液体培养基中，愈伤组织生长迅速，20 d平均增加重量达53．
2．3 HPLC法测定八角莲愈伤组织中的鬼臼毒素含量色谱条件：Zorbax sB c18色谱柱(
标准曲线的绘制：精确称取鬼臼毒素对照品10 mg，用色谱甲醇配成1 mg·mL一的溶液，作为储备液，依次稀释成15．0，30．0，60．0，100．0，300．0，600．O μg·mL的溶液，分别进样10 IxL。以对照品溶液的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标得回归方程：y=4．122 3x+54．433，r=0．999 5，线性范围15．0～600．O μg·mL～。
样品溶液的制备：取新鲜愈伤组织
精密度：取鬼臼毒素对照品储备液稀释成一定的浓度，连续进样6次，每次进样10 IxL，求得RSD=1．2％。
样品的测定结果：1号培养基中愈伤组织含鬼臼毒素为0．11％，2号培养基为O．13％，3号培养基为0．20％，4号培养基为O．15％，5号培养基为 O．17％，6号培养基为0．22％，7号培养基为 O．23％，8号培养基为0．26％，原植物叶片中含量为0．95％。
从鬼臼毒素的含量测定结果看出，愈伤组织中的鬼臼毒素含量远低于原植物叶片中的含量，其次生代谢产物的积累尚有待提高。
2．4饲喂前体对八角莲愈伤组织中鬼臼毒素积累的影响经过振荡培养的八角莲愈伤组织，含测后发现其中的次生代谢产物积累有限，经过多次继代仍未有改观。文献报道称添加鬼臼毒素的前体化合物苯丙氨酸(Phenylalanine)可以大大提高愈伤组织合成次生代谢产物。作者考察了在液体培养基中添加不同浓度的苯丙氨酸(0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．
3讨论
经过反复筛选液体培养基中激素的配比，试验发现，3代之前的愈伤组织在MS+NAA O．2 mg L+6．BA3．O mg·L中分裂速度快，生长旺盛。在3代之后继代培养中，就应该及时逐步降低6-BA的浓度，否则会由于组织内部自生激素而使激素量过高，不利于组织生长。
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