药用蛋白水解酶在天然药物研究和生产中的应用进展

李婷菲，于荣敏 (暨南大学药学院，广东广州 510632) 蛋白水解酶(proteolytic enzyme)有时也称为蛋白酶(pro—tease或proteinase)，是指用于切断蛋白质分子内部肽键，使蛋白质分子变成小分子多肽或氨基酸的内切(肽)酶，是目前医药行业中应用最广的一类酶。蛋白水解酶在工农业和医药生产上有着广泛的应用。在临床上常用作消化酶、消炎酶，如用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶等治疗炎症和浮肿疾患，以清除坏死组织；还可用于加工业，如用相应的蛋白酶生产氨基酸；用无色杆菌来源的蛋白酶或胰蛋白酶水解、更换猪型胰岛素B链羧基端的Ala为Thr，使之改造为人型胰岛素。 此外，近年来对活性肽的独特生理功能的研究与发现使得人们对蛋白水解酶的研究和应用更加关注。本文综述了药用蛋白水解酶的类型、专一性及其在天然药物和新药开发研究中的应用和进展。 1蛋白水解酶的类型 1．1来自微生物的蛋白水解酶：主要分为细菌产生的蛋白酶、霉菌产生的蛋白酶、酵母产生的蛋白酶和放线菌产生的蛋白酶。细菌类蛋白酶主要由枯草杆菌等芽孢杆菌产生，一般是中性或碱性蛋白酶。如由地衣芽孢杆菌Bacillus lichen~formis(Weigmann)Chester emend．Gibson发酵产生的碱性蛋白酶Alcalase，芽孢杆菌Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn发酵产生的内肽蛋白酶Corolase 7089等。霉菌可产生3种蛋白酶，如米曲产生的蛋白酶以中性和碱性为主，黑曲则主要产生酸性蛋白酶。酵母菌产生的一般是胞内蛋白酶，放线菌产生的是中性和碱性蛋白酶。 1．2来自动物的蛋白水解酶：来自动物消化道的蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶(pepsin)、胰凝乳蛋白酶(麋蛋白酶，chymotrypsin)；来自血液的蛋白酶有凝血酶(thrombin)。此外，还有透明质酸酶等。 1．3来自植物的蛋白水解酶：来自植物的蛋白酶主要有木葛瓜蛋白酶(papain)、菠萝蛋白酶(bromelin)、无花果蛋白酶目(ficin)、木瓜凝乳蛋白酶(ehymopapain)等。 根据蛋白酶作用的最适pH，可将其可分为中性、碱性和酸性蛋白酶；根据其活性部位的特点又可分为巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等也有的蛋白酶含有金属离子，称为金属蛋白酶。 2蛋白水解酶的专一性 蛋白水解酶对其水解的肽键相邻的基团有一定的专一性要求。例如，胰蛋白酶要求它的水解肽键的羧基端为碱性_氨基酸，如赖氨酰一、精氨酰一；而胰凝乳蛋白酶则要求是芳香族氨基酸，如酪氨酰一、色氨酰一等。表1列举了一些蛋白水解酶的专一性要求。 3蛋白水解酶在中药及天然药物研究和生产中的应用 3．1 蛋白水解酶在中药及天然药物提取分离中的应用：大部分中药材有效成分往往包裹在细胞壁内，在药用植物有效成分提取过程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。选用适当的酶作用于药用植物材料，有利于有效成分的溶出。此外，中药及天然药物中的杂质大多为淀粉、果胶、蛋白质等，针对杂质可选用合适的酶法予以分解除去。各种蛋白酶反应可较温和地将植物组织分解，除去蛋白质杂质，且可大幅度提高收率。曹惠芳等将木瓜蛋白酶用于补骨脂煎煮前的预处理，由于破坏了补骨脂种子的蛋白质，防止了蛋白质遇热凝固，故有利于其有效成分的提取。 此外，酶法还可应用于中药花粉多糖、药用菌胞内多糖及动物药多糖的提取。杨云等Ⅲ在提取大枣渣多糖时用蛋白酶水提取法和其他常规的提取方法进行比较。实验选用木 瓜蛋白酶，加入酶后在50℃的温水中浸没1 h，再用80℃热水提取。酶一水法提取可分为2个过程，第一阶段为酶促细胞破壁过程，主要作用是酶解细胞表面结构及胞间连接物，并有部分糖类物质的溶出；第二阶段是胞内物浸出过程，通过提高温度，既达到灭酶的目的，同时也可使溶于热水的胞内物浸出率增加。研究结果发现，酶加水提法的多糖得率和量最高，且提取时间缩短。同样，陈哲超采用复合酶和热水浸提法综合分离纯化香菇中多糖蛋白，与单纯热水提取相比，总氨基酸与必需氨基酸的量均提高了2倍以上，香菇多糖量提高了4倍，且酶解后大大改善了糖类的分布，其中具有抗病毒活性的较高相对分子质量的多糖量明显提高。范秀萍等在研究珠母贝氨基多糖时，确定了蛋白酶水解的最佳条件：先加入胰酶1．5％，50℃，pH 8．o水解4 h后，再加入枯草杆菌中性蛋白酶o．8％，50℃，pH 7．0水解4 h，水解率达89·2％，且证明水解产物能增强抗肿瘤药物5一Fu对肿瘤的抑制作用。肖凯军等在提取鲨软骨黏多糖时也同样采用了双酶法，水解率和多糖得率都比单酶法要高得多，获得了较好的提取效果。这主要是因为蛋白酶水解的特异性，单独的蛋白酶只能有限地水解底物，而采用双酶水解体系则能广泛水解蛋白质，尽可能多地提取多糖组分。 中药及天然药物用酶法提取，收率明显提高，具有很大的应用潜力，但该技术也存在着一定的局限性。如酶法提取对实验条件要求较高，为使酶发挥更大作用，需先通过实验确定最适温度、pH及最适时间等。因此，要拓宽其应用领域，还需要进一步深入探讨酶的浓度、底物的浓度、温度、pH、抑制剂和激动剂等对提取物的影响。相信随着该领域研究的不断深人，必将为中药及天然药物的提取提供一条新的途径。 3·2 蛋白水解酶在生产活性肽中的应用：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽类成分。以前人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。近年来，科 学家研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用。天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素等生物体的次级代谢产 物以及各种组织、骨骼、肌肉、免疫系统、消化系统、中枢神经系统中存在的活性肽，这些活性肽大部分量较少，或提取困难，不足以大量生产供给所需。因此，越来越多的人们把目光 投向了开发蛋白酶解产物上。 3·2·1 生产具有免疫刺激活性的多肽：张东送等嘲在研究牛乳铁蛋白(BLF)对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响时采用了胃蛋白酶对BLF进行酶解的方法，酶解产物为LFPH(1acto— ferrin pepsin hydrolysate)。结果发现BLF对小鼠的脾淋巴细胞的增殖具有显著的抑制作用，而LFPH则具有显著的促进作用。其原因可能是BLF经胃蛋白酶酶解成短肽后，破坏了其长链上对脾淋巴细胞增殖的抑制成分，显露了具有免疫促进作用的短肽，从而促进脾淋巴细胞增殖和抗体、细胞因子的生成，从而起到提高机体免疫力的作用。 3·2·2生产抗高血压活性肽：血管紧张素转换酶(ACE)在人体血压调节过程中起重要作用，它催化血管紧张素I从2”端裂解二肽形成血管紧张素I(肾素．血管紧张素系统中 已知活性最强的血管收缩剂)；同时，它能钝化血管舒张剂一舒缓激肽。ACE抑制肽通过抑制ACE的活性，可使血管紧张素Ⅱ的生成和激肽的破坏均减少，从而达到治疗高血压的目的。 李朝慧等分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白ACE抑制剂。结果显示：碱性蛋白酶酶解产物的抑制率最高，达90％以上；实验还确定了碱性蛋白酶水解的最佳条件：温度为50℃，底物质量浓度为O．05 kg／L，质量比为5．5％，时间为6 h。 在对中国毛虾ACE抑制肽的过程中，章超桦和许萍分别用胃蛋白酶和3942中性蛋白酶对中国毛虾进行酶解。胃蛋白酶的最佳工艺条件：pH 2．4，温度41℃，酶解时间3 h，酶量900 u／g底物，底物质量分数8％，酶解产物对ACE抑制率达到91．41％；3942中性蛋白酶的最佳工艺条件：料水比1：3，酶量O．5％，温度45℃，时间8 h，酶解产物的ACE抑制率为92．86％，在经过分离纯化后得到一新型的ACE抑制肽Ser—Pro，IC50值为272／~mol／L。欧成坤等用酸性蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶酶解牡蛎，并对两者的酶解产物在ACE抑制活性、清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH‘自由基方面进行比较，发现了酸性蛋白酶酶解产物在各方面都要优于后者。 具有抗高血压作用的还有来自植物蛋白的肽类。如来自玉米的多肽，a、Y玉米醇溶蛋白的酶产物都具有抗高血压作用；来自大豆的多肽，大豆蛋白经限制性内切蛋白酶水解可以得到以相对分子质量低于1 000为主的低聚肽。 3．2．3生产促进微量元素运输的多肽：β酪蛋白及全酪蛋白可以用多种蛋白酶消化，释放出酪蛋白磷肽(CPPs)Ets3。分布于a，β酪蛋白等牛乳蛋白的不同区域。CPPs能促进钙、锌和铁的吸收。 3．2．4生产抗氧化作用的多肽：胡文琴等以羟自由基清除率为衡量指标，筛选木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶这3种蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件。试验发现：酪蛋白酶酶解物比酪蛋白具有更强的羟自由基清除能力，推测可能是酪蛋白的高度结构可能不利于与自由基产生作用，而在酶解过程中，释放出具有抗氧化活性的小分子肽和游离氨基酸，暴露能参加反应的氨基酸侧链基团，因此水解物的清除能力远大于母本蛋白。 3．2．5生产肿瘤抑制多肽：据报道，有通过用动物体内固有的胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白，筛选并获得了一种具有促进免疫和抗菌功能的生物活性肽。因其富含酪氨酸，将其命名为富含酪氨酸免疫活性肽(Trpi)。 近年来，海洋蛋白资源利用越来越受到人们的更多关注。海洋生物体内的各种活性物质是开发研究海洋生化药物与功能性保健食品的原料宝库，21世纪将是人类研究、开发、利用海洋生物资源的黄金时代。将陆地酶工程技术应用于海洋蛋白酶解活性肽的研究，在此基础上，加强用于海洋蛋白源酶解的专用蛋白酶制剂的开发。在这方面，蛋白水解酶将有更加广阔的发展前景。 3．3其他方面的应用：除以上所提及的应用之外，蛋白水解酶还作为其他治疗酶出现在医药领域。国外有关研究表明，胰蛋白酶及蛋白酶激活受体一2(PAR一2)在胃癌、大肠癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌等恶生肿瘤中表达，且与其恶性行为密切相关。胰蛋白酶不仅对细胞外基质的降解发挥重要作用，还能作为一种生长刺激因子，活化蛋白酶激活受体一2，促进细胞增殖。该研究为抗肿瘤转换治疗提供了一个重要靶点，为相应的抗肿瘤药物的开发提供了一定的理论基础，为无细胞毒性的肿瘤治疗方法开辟新的途径。 将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素、阿莫西林等)联用，能提高其疗效。相关研究结果表明，它能促进抗生素在感染部位的传输，从而减少抗生素的用药量。庞然等Ezl3的研究结果表明，使用抗生素加用菠萝蛋白酶肠溶片治疗慢性前列腺炎疗效明显优于单独使用抗生素，动物试验结果表明菠萝蛋白酶能促进不同药物渗透到组织和器官中，增加血和尿中抗生素水平，它对抗生素药物的增强效应主要归功于菠萝蛋白酶促进吸收，并增强病变组织的通透性，从而使抗生素易于达到感染部位。 4展望 药用蛋白水解酶制剂作为一种生物催化剂，是应用最早、效益最显著、研究也十分活跃的一个领域。蛋白水解酶在中药提取和生产活性肽方面，都有作用条件温和、收率高等诸多优点。但同时，该技术也存在着一定的局限性：酶的最佳温度及最佳ph值往往在一个很小的范围内，故要使酶的活性提高到最大值，必须严格控制酶反应的温度及pH值，反应条件的微小波动，都可能使酶的活性大大降低，因此对实验设备有较高的要求。酶法提取中药的过程中，有可能改变中药中某些成分，产生新的化学物质，从而影响产物的纯度及得率。此外，作为药物酶，还存在着容易被降解、被代谢、药效期短、酶制剂纯度不高、杂质可能导致副作用等弊端。但这些问题同时又是促进蛋白水解酶制剂发展的潜力和动力，不论从基础理论研究角度考虑，还是从工业应用方面着想，不断完善并大力研发新型的工程酶和将药物酶微型胶囊化及制成衍生物等都是药用蛋白水解酶未来发展的主要方向。

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