蟑螂提取物抗肝损伤及抗病毒作用探讨

高永翔 扈晓宇 钟森 龚立 蟑螂味咸、性寒，入肝脾经，功擅活血化瘀、破坚消积、下气利痹。《本草纲目拾遗》载“灶马（蟑螂）治气虚中满，膨胀，一切儿疳”，民间有用蟑螂治疗肝炎、肝硬化、肝癌者。我们对蟑螂进行提取，初步探讨了蟑螂提取物的抗肝损伤及抗病毒作用。 1 材料与方法 1. 1材料 1.1.1药物:蟑螂提取物(由成都中医药大学中试中心提供),复方鳖甲软肝片(江苏正大晴药业股份有限公司)，拉米夫定片(葛兰素史克公司)。蟑螂提取物为蟑螂的全虫经醇、水双提后干燥得到的棕黑色粉末，主要含异性蛋白，尚不清楚其具体分子结构。 1．1．2试剂：CCl4(徐州试剂厂)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司)、、卡介苗(成都生物制品研究所)、脂多糖(LPS)、四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)、DMEM干粉、胎牛血清(GIBCO公司生产)、G-418(Fluko公司)、HBV试剂盒(Abbott公司)。 1．1．3细胞株及动物：体重18～22g的昆明种、C57BL／6J I级小鼠，雌雄各半，均由中国医学科学院输血研究所实验动物中心提供。经HBV-DNA克 隆转染人肝癌细胞(HepG2)细胞株(2．2．15)，引 自北大医学院病毒室，能转录HBV基因，并产生 HBsAg、HBeAg。于成都中医药大学附属医院细胞室进行传代培养，37~C、5％C02，DMEM培养液中含G418和小牛血清。麻鸭，雌雄不限，体重l～2kg(购自温江种鸭场)。 1．1．4仪器：7530型紫外分光光度计(惠普)、Napco-C02孵箱(杜邦)、倒置显微镜(OLYMPAS)、酶免生化仪(IMX)、UV-120-02型分光光度仪(岛津)。 1．2蟑螂提取物对CCl4诱导小鼠肝损伤的保护作用 1．2．1肝损伤模型的制作：按照文献介绍的方法，于开始给药后第7 d，以0．01 ml／g体重剂量比在昆明种小鼠皮下1次性注射O．12％CCl4花生油溶液，制作急性肝损伤小鼠模型。 1．2．2分组与给药：将小鼠随机分成6组，每组10只，雌雄各半。①正常对照组：按体重予以蒸馏水0．02 ml／g：②模型组：给予蒸馏水0．02 ml／g：⑨低剂量组：给予肝损伤模型小鼠低剂量蟑螂提取物(1．83 g生药／kg、为成人用量的5倍)，药液浓度为0．092 g生药／ml，按0．02 ml／g灌胃，每日1次，连续7 d；④中剂量组：按0．02 ml／g给肝损伤模型小鼠中剂量蟑螂提取物(3．67 g生药／kg、为成人用量的10倍)灌胃，药液浓度为0．183 g生药／ml，每日1次，连续7 d；⑤高剂量组：按0．02 ml／g给予肝损伤模型小鼠高剂量蟑螂提取物(5．50 g生药／kg、为成人用量的15倍)灌胃，药液浓度为0．275 g生药／ml，每日1次，连续7 d；⑥复方鳖甲软肝片组(鳖甲片组)：给予肝损伤模型小鼠复方鳖甲软肝片1．5 g／l【g(药液浓度为0．075 edrrd、给药体积为0．02 ml／g体重，为成人用量的15倍)灌胃，每日1·次， 连续7 d。 1．2．3肝功能检测：上述6组分别在蒸馏水、蟑螂提取物、复方鳖甲软肝片末次灌胃后24 h，摘取小鼠眼球采血，分离血清，测定血清ALT、AST活性。 1．3蟑螂提取物对免疫性肝损伤小鼠的保护作用 根据文献介绍的方法制作免疫性肝损伤小鼠模型，在C57BL／6J小鼠尾静脉注射卡介苗混悬液0．2 ml／只(5×106个菌)致敏，10 d后再次经尾静脉注射LPS 7．5μg/只，诱导免疫性肝损伤小鼠模型。将C57BL／6J小鼠随机分成6组，每组10只，雌雄各半。分组及蟑螂提取物、复方鳖甲软肝片用量同1．2．2。从尾静脉注射卡介苗的第1天开始灌胃给药，每日1次，连续10 d。肝功能检测方法同1．2．3。 1．4蟑螂提取物的抗HBV作用 1．4．1含药血清的制备：麻鸭18只，随机分成蟑螂提取物组、拉米夫定组、空白对照组(每组6只)，预饲1周后，蟑螂提取物组以5．5 g／kg(相当于人日用量的15倍)，25 ml／次、2次／d灌胃；拉米夫定组以11．5 mg／kg(相当于人日用量的15倍)，25 rnl／次、2次／d灌胃；空白组以双蒸水25 ml／次，2次／d灌胃；均连续灌胃3 d。末次灌胃1 h后颈动脉采血，分离血清，56~C、30 min灭活，用0．22 gm微孔滤膜过滤除菌，置于一20℃冷冻备用。 1．4．2 HBsAg／HBeAg表达抑制率的检测：经HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞(HepG2)细胞株以5×10个，lIll浓度接种于96孔板上，0．1 ml／孔，37℃ 5％C02培养，根据不含药血清在细胞中的最佳添加量，分成4种浓度(80％、60％、40％、20％)分别添加空白血清、含拉米夫定或蟑螂提取物的药物血清，每组设3个副孔，终体积为200μL每天收集培养上清液，用含药血清或血清补足原量至第13天，培养上清液一30℃液组为对照，检测HBsAg、HBeAg含量。 1．4．3评价方法：参照Reed-Muench方法计算药物浓度为50％时细胞毒性浓度(CDso)和50％HBV抑制浓度(ID50)，并计算其治疗指数(TI)药物抗HBV效果以TI评价。TI=CDso(半数中毒剂量)／IDso (半数抑制剂量)。TI>2为有效，TI越大表明该药物对HBsAg或HBeAg抑制作用越大。 1．5统计方法：组间定量比较用Durmett f检验，检测结果用х±s表示。 2结果 2．1 蟑螂提取物对急性肝损伤模型小鼠血清ALT和AST活性的影响 急性肝损伤模型动物血清ALT和AST活性较正常对照组分别升高463．93％和766．36％(P均< 0．01)。蟑螂提取物高、中、低3种剂量均可降低急性肝损伤小鼠升高的AST活性，蟑螂提取物高剂量和中剂量可使升高的血清ALT活性分别降低50．93％和31．64％(P均<0．01)。 2．2 蟑螂提取物对免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT和AST活性的影响 免疫性肝损伤模型小鼠的血清ALT和AST活性较对照组分别升高481．82％和313．59％(P均<0．01)。蟑螂提取物高、中、低剂量组均可使升高的血清ALT活性显著降低(P<0．01)，高剂量和中剂量对升高的血清AST活性降低作用明显(见表2)。 2.3蟑螂提取物抗HBV的作用 体外抗病毒实验表明，20％、40％、60％、80％蟑螂提取物含药血清对2．2．15细胞分泌HBsAg的抑制率分别为18％、39％、65％、83％，其中，20％蟑螂提取物含药血清的IDso、CDso、T1分别为60、221、3．68；对HBeAg抑制率分别为15％、29％、43％、73％，20％蟑螂提取物含药血清的ID50、CD50、11分别为42、96、2．29。不同浓度的蟑螂提取物1fI值均大于2，表明对nasag、HBeAg均有抑制作用(见表3)。 3讨论 分别用CCl4、卡介苗诱导动物肝损伤，同时采用这两种经典的肝损伤模型进行研究，发现蟑螂提取物具有较强的抗肝损伤作用。本研究所采用的2．2．15细胞株系转染HBV基因组的人肝癌细胞株，能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，是目前常用的抗病毒药物筛选细胞模型3-5，通过血清药理学方法发现蟑螂提取物具有一定的抑制病毒复制HBsAg和HBeAg作用。 试验结果提示，蟑螂提取物同时具有抗HBV作用及抗肝损伤作用，其作用机理可能与免疫调节作用有关，相关实验结果将进一步总结。

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