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  • 糖尿病动物模型研究进展及在中药研究中的应用

  • 来源: 作者:成龙 申竹芳 孙桂波 时间:2015-09-29 08:57:35
  • 核心提示:2013年IDF的统计数据显示全世界有3.86亿人患糖尿病,超过80%的糖尿病死亡发生在低收入和中等收入国家。最新报道,我国糖尿病患者约有1.139亿,处于糖尿病前期的人群更加庞大,因此,

    2013年IDF的统计数据显示全世界有3.86亿人患糖尿病,超过80%的糖尿病死亡发生在低收入和中等收入国家。最新报道,我国糖尿病患者约有1.139亿,处于糖尿病前期的人群更加庞大,因此,糖尿病防治研究已经成为全球医学界的重大和疑难课题。以往糖尿病治疗一直强调和关注强化降糖,美国糖尿病控制与并发症研究(DCCT)及英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)是迄今为止规模最大、随访时间最长的前瞻性随机对照试验研究,旨在明确强化血糖控制与血管并发症之间的关系。结果发现,与采取常规治疗方案的患者比较,采取强化血糖控制的患者微血管并发症(视网膜病变、肾病及神经病变)减少60%以上;但均未能明确证实强化血糖控制可显著降低大血管病变风险。新近的ADVANCE、ACCORD和VADT等大型前瞻性临床研究也得到类似结论。这些结果表明糖尿病并发症的防治需要在长期强化血糖控制的同时进行多种危险因素的综合干预。糖尿病对人体健康的最大危害在于其并发症,糖尿病并发症分为微血管(小血管受损)并发症和大血管(大血管受损)并发症。近年来从人参、三七和黄连等单味中药和消渴丸、金芪降糖和津力达等代表中药复方的降血糖或改善并发症的研究工作进展迅速,已经能体现中成药的综合疗效,成为新的热点和研究开发方向。

    一、糖尿病动物模型研究进展

    在药物有效性评价中,实验动物模型是最常用和可靠的工具之一。化学损伤和手术切除胰腺等传统的糖尿病动物模型仅能出现显著的血糖升高,未能体现高胰岛素血症和胰岛素抵抗等2型糖尿病的特征,与糖尿病的自然进程相去甚远,这些缺陷和不足制约了其对药效评价中的降糖作用及特点的有效评价。近年来,随着生物技术的快速发展,糖尿病动物模型得到了快速发展,特别是各种自发性和转基因糖尿病模型的广泛应用并迅速得到行业内的公认,这些模型对于糖尿病病因学、治疗及新药发现等研究更具价值。现将主要的动物模型综述如下:

    糖尿病动物模型主要分为三类:
    (1)实验性糖尿病动物模型;
    (2)自发性糖尿病动物模型;
    (3)转基因糖尿病动物模型。

    1.实验性动物糖尿病模型
    实验性糖尿病模型是用各种方法损伤胰或胰岛β细胞导致胰岛素缺乏,从而引起实验性糖尿病或实验性高血糖。

    1.1 胰腺切除性糖尿病模型
    早在1890年Mehring及Minkowski发现切除狗胰腺后可使动物产生糖尿现象,此后,通过改良成功建立了较为稳定的1型糖尿病动物模型,该模型缺陷包括手术操作较为复杂、选择性欠佳,可引起其他胰腺内分泌激素如生长抑素、胰高血糖素和胰多肽的缺乏,现已较少采用。

    1.2 化学性糖尿病模型及在中医药研究中的应用
    通过化学药物损伤胰脏可形成糖尿病模型,化学药物常用四氧嘧啶(alloxan)和链尿佐菌素(streptozotocin,STZ)。四氧嘧啶产生超氧自由基能选择性破坏多种属动物的β细胞,引起实验性糖尿病。链脲佐菌素是对胰岛β细胞有着特异毒性的天然化合物,可自行分解活泼的甲基正碳离子与DNA呈链间交叉连结,从而使DNA烷化,STZ在体内可形成异氰酸盐从而与核酸蛋白结合,抑制DNA多聚酶活力,使受损的DNA难于修复。二者均可选择性损伤多种动物胰岛β细胞,影响胰岛素合成,从而引起实验性糖尿病。

    四氧嘧啶:实验大鼠空腹尾静脉或腹腔注射四氧嘧啶,血糖达16.7 mmol•L-1以上,稳定2周后可作为成功模型,建模最初成功率约85%;最终成功率约60%,因部分大鼠胰岛细胞破坏可自行缓解,模型目前已较少应用。在较早的中医药研究也采用了该模型研究结果。提示:黄芩苷具有降血糖活性,黄精多糖具有抗氧化降血糖和血脂作用,发酵人参具有较好降血糖作用,机制可能与其提供机体抗氧化应激有关。

    链尿佐菌素:
    (1)速发型:1次足量给予大鼠STZ,造成β细胞大量损伤,胰岛素合成和分泌减少,引起糖代谢紊乱,导致糖尿病。大鼠禁食10 h,按50 mg•kg-1腹腔内1次注射STZ溶液,24 h内血糖≥16.8 mmol•L-1,稳定5 d即为成功模型。此法较适于1型糖尿病相关研究。
    (2)迟发型:福氏完全佐剂,可激发机体免疫功能。大鼠第1天腹腔注射0.5mL CFA,次日按25 mg•kg-1腹腔内注射STZ溶液。每周1次,连续3周,第3周成模型率可达87.5%。此方法有免疫学的改变,更接近人类1型的发生发展变化。
    (3)STZ联合高脂饮食:先以高糖高脂饲料喂养大鼠1个月,诱发出胰岛素抵抗,继以低剂量链尿佐菌素(STZ 25-30 mg•kg-1)。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、成功率高等特点,多用于评价治疗2型糖尿病的药物疗效。此模型缩短了造模时间而且符合人类疾病的病理生理改变。
    (4)Alloxan、STZ联合给药:既能降低单用Alloxan对肝、肾的损害,又弥补单用STZ剂量过大而致动物死亡或剂量过小而致成模率低的不足。造摸成功的标准:24 h内血糖≥16.8 mmol•L-1,稳定5 d即为成功模型或随机血糖≥11.1 mmol•L-1且持续2周。链尿佐菌素所致糖尿病动物模型在中医药研究中得到了广泛应用,降糖消脂胶囊、糖微康、消渴颗粒、周络通等多种临床行之有效的经验方在取得较好的临床疗效同时开展了基础研究,采用了STZ单独造模或者STZ联合高脂饲料喂养造模,研究结果均提示临床经验方能较好改善异常血糖和血脂水平、对胰岛或肝脏病变有一定缓解作用,对糖尿病并发的周围神经病变、微血管病变有一定干预作用,降糖作用机理与改善胰岛素抵抗相关。

    目前,国内常用高脂饲料喂养加小剂量的STZ损伤部分β细胞造模进行中药降糖作用评价,但是该模型建立时间长,易受多种因素的影响,如饲料的质量和口味、STZ的用量和注射方法等,使得模型稳定性不佳。STZ诱导的糖尿病动物模型还能表现出一些糖尿病的并发症,如糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病。本实验室在既往研究工作中采用STZ诱导的糖尿病动物模型进行中药防治糖尿病视网膜病变的药效学评价研究,该研究结果获得了FDA审评组的认可,为中药进军国际市场提供了良好的技术支撑。

    1.3 其他实验性糖尿病模型包括:免疫性、激素性和病毒性糖尿病模型。这类模型在目前的新药有效性评价中较少使用。

    2、自发性糖尿病动物模型
    自发性疾病动物模型是指未经人工处置,在自然情况下发生疾病,病理生理与人类某种疾病有相似之处,或通过遗传育种培养而保留下来的疾病动物。自发性糖尿病动物其表现与人类糖尿病相似,目前国内外常用于研究糖尿病的病因和发病机制,也可用于筛选糖尿病药物及其作用机制研究,具有重要价值,是较理想的糖尿病模型。不同的自发性模型有不同的发病机制,根据不同机制和病理表现,可用于不同类型的糖尿病药物的评价。如中国地鼠、BB大鼠、NOD小鼠等,有自身免疫病因参与、胰岛β细胞受损,因而胰岛素缺乏、血糖升高,主要用于1型糖尿病的病因及病理生理,及用于1型糖尿病药物如口服胰岛素制剂的有效性评价。在FDA的糖尿病药物研发指南中BB大鼠和NOD小鼠是常用来进行1型糖尿病药物研究的动物模型。胰岛素抵抗型自发性糖尿病动物则多数肥胖,有高胰岛素血症,类似人类2型糖尿病的特点,如ob/ob、db/db、KK、NZO小鼠、Obese Zucker、Goto-Kakizaki(GK)、SHR/N-cp、OLETF大鼠等,其中ob/ob、db/db和Obese Zucker是FDA糖尿病药物研发指南所述的2型糖尿病常用动物模型,国外开发口服降糖药及并发症的新药多选用此类动物。自发性糖尿病模型种类较为繁杂,因为品种来源和经济因素等原因,大部分目前在国内尚未广泛使用。以下仅简介FDA指南中提到的部分常用的模型:

    2.1 NOD小鼠:NOD(Non-obese diabetic)小鼠是JCL-ICR品系小鼠衍生的CTS(白内障易感亚型)糖尿病小鼠近亲杂交而来的,为一种自发性非肥胖DM小鼠是典型的1型糖尿病模型。继发于β细胞的自身免疫性损伤,并伴有胰岛炎和自身抗体生成,其发病年龄和发病率有着较为明显的性别差异,雌鼠发病年龄明显早于雄鼠,发病率亦远高于雄鼠,NOD小鼠3-5周龄时开始出现胰岛炎,7周龄发病NOD小鼠血糖值一般高于11.0 mmol/L。NOD小鼠是遗传、免疫和自由基损伤多因素综合作用的结果 ,是研究关于1型DM遗传学、免疫学、病毒学特征及其预防和治疗等方面的良好动物模型。NOD小鼠还多用于糖尿病视神经病变的观察。

    2.2 BB大鼠:BB(diabetes-prone Bio Breeding)大鼠是和自身免疫性毁坏胰腺β细胞的胰岛炎及胰岛素缺乏有关的糖尿病模型,有常染色体隐性遗传的特性,是一种自发性、遗传性1型糖尿病动物模型。发病时间为出生后50~213日(平均117日)。临床表现为高血糖(200~794mg/dl)及酮尿,尿糖含量为20~270mg/dl,体重增长低于对照组(远交系Wistar大鼠),摄食量与排尿量皆高于对照组(P<0.05) 。主要用于1型糖尿病的病因及病理生理及1型糖尿病药物如口服胰岛素制剂的有效性评价。

    2.3 ob/ob小鼠:为2型糖尿病动物模型,属常染色体隐性遗传。纯合子动物表现为肥胖、高血糖及高胰岛素血症。症状的轻重取决于遗传背景,ob/ob小鼠与C57BL/KsJ交配的子代症状严重,而ob/ob与C57BL/6J交配的子代症状则较轻,后者是杂合体。由于ob/ob小鼠瘦素基因突变,导致瘦素缺乏,C57BL/6 ob /ob小鼠4周龄时发生轻度肥胖,表现出高胰岛素血症和糖耐量受损,但是没有形成糖尿病,在15周龄时才发生严重的肥胖和糖尿病。除了摄食过量外,ob /ob小鼠还表现出体温下降,身体脂肪含量增加,能量消耗和活动度降低,大约14月龄时死亡。研究发现它和人类2型糖尿病不同的是不具有血液的高凝状态,因此不能用于糖尿病脑血管和心血管并发症方面的研究。ob/ob小鼠leptin(ob基因产物) 缺乏,引起肝脂肪生成和肝糖原异生,高血糖又刺激胰岛素分泌,引起胰岛素抵抗的恶性循环。该模型可用于口服降糖药,尤其是胰岛素增敏药的评价。

    2.4 db/db小鼠:db/db小鼠由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来,属2型糖尿病模型。db /db 小鼠是Leptin受体基因缺陷导致的先天性2 型糖尿病小鼠,主要表现为下丘脑缺陷,对饱感物质( 瘦素) 缺乏反应,具有高血糖、高胰岛素血症、糖代谢异常等特征,其体型极胖,在一个月时开始贪食及发胖,继而产生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也升高,一般在10个月内死亡。C57BL/6J db/db糖尿病小鼠发生严重的糖尿病症状类似C57BL/KsJ ob/ob小鼠,即早发的高胰岛素血症,体重下降和早死。db/db小鼠与ob/ob小鼠不同之处在于db/db可发生明显的肾病。是使用较多的自发性2型糖尿病动物模型,动物具有高胰岛素血症,血清脂肪酸和甘油三脂升高。

    自从引进db/db小鼠之后,以db/db模型为工具的研究主要集中在中药来源的单体及有效部位的抗糖尿病及并发症研究。本实验室在糖尿病基础研究关键技术平台中重点采用db/db自发性糖尿病动物模型进行中药复方降糖和干预并发症的研究工作,提升了中药复方降糖研究的技术水平,为中药新药上市提供了良好的技术支撑。同时在研究采用OCT技术观察中药复方对糖尿病并发视网膜病变(视网膜微血管瘤)的干预作用,结果发现在中药复方和二甲双胍在降低糖化血红蛋白作用强度近似的条件下,中药复方能显著减少视网膜微血管瘤的发生情况,相关结果发表在JDR杂志。结果体现了中药复方对糖尿病的综合干预效果和优势,为新产品上市获批提供了重要的科学依据。

    2.5 (ZDF)大鼠:ZDF (Zucker diabetic fatty rat) 大鼠是一种基因编码瘦素Leprfa 等位基因突变形成自发性的纯合子糖尿病大鼠。ZDF大鼠发生肥胖,高胰岛素血症,高血糖,高瘦素以及高甘油三酯和脂肪酸。ZDF大鼠在6周龄时便出现胰岛素抵抗,高血糖开始于6周龄左右,在10-12周时出现稳定的高血糖,血清胰岛素水平开始下降。6周龄大鼠胰岛即表现有结构紊乱和纤维化、胰岛β细胞脱颗粒现象,同时胰岛β细胞数量远低于相同周龄的非DM,是常用的自发型肥胖2型糖尿病动物模型。

    2.6 KK小鼠: KK小鼠是一种轻度肥胖的2型糖尿病动物。KK小鼠明显多食,从5周龄起血糖、血胰岛素以及HbA1c水平逐步升高,至5月龄时非空腹血糖常高于17mmol/L,非空腹血胰岛素可达1200ug/mL,KK小鼠寿命明显缩短。KK小鼠空腹胰高糖素水平升高,且不受葡萄糖抑制。组织学显示β细胞有脱颗粒和糖原浸润,随后出现胰岛肥大和肝脂肪化和脂肪组织增多。KK-Ay是将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠而得,为常染色显性遗传。与KK小鼠相比,有明显的肥胖和糖尿病症状。肝脂肪化和脂肪组织增多,肾脏可见早期迅速发展的肾小球基底膜增厚。KK-Ay小鼠后期肾小球细胞系膜增殖和细胞外基质聚集会进一步恶化形成糖尿病肾病,因此常用于糖尿病肾病的研究中。

    近来研究较充分的有人参和黄连两味名贵中药。人参及人参有效单体组份,在多种动物模型中均表明人参皂苷具有显著的降糖活性,作用机理涉及包括GLP-1、改善胰岛素抵抗、激活炎性通路和氧化应激、AMPK等多个信号通路。黄连及小檗碱等生物碱在多种动物模型中和人体研究中均表现显著的降糖活性及对糖尿病并发神经病变的干预作用,其作用机制概括起来可能包括:增加脂肪代谢和减少其合成改善脂质代谢,进而可减少体重,显著改善葡萄糖耐量,改善胰岛细胞的凋亡,神经细胞突触的可塑性等。

     3、转基因糖尿病模型(Transgenic diabetes model)
    为了阐明或研究特定基因在糖尿病病理中的作用,通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造,并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。这样我们可以在动物基因组的特定位点引入所设计的基因突变,模拟造成人类遗传性疾病的基因结构或数量异常;可以通过对基因结构进行修饰,在动物发生、发育的全过程中研究体内基因的功能及其结构/功能的关系。KK-Ay小鼠动物模型即是将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠而得。随着分子生物学、基因技术的发展及其在科学领域中的应用,利用基因敲除技术复制糖尿病模型已取得突破性进展。目前有单基因敲除和多基因敲除两种方法,目前此种模型建立方法主要产生2型糖尿病症状,是2型糖尿病模型。有关1型、2型DM和青少年发病的成人型糖尿病(maturity- onset diabetes ofyouth,MODY)的转基因DM动物均有报道。此外,转基因动物模型还有MODY3模型,妊娠糖尿病模型如杂合体C57BL/KsJ-db/+小鼠等。

    二、中药降糖的特点和优势,如何有效开展研究

    据南方医药经济所的统计数据显示:中成药在整个口服降糖药市场份额中仅占不到一成,处于辅助用药的位置。原因可能有:中药降糖作用弱、缺乏降糖疗效的询证医学证据;临床定位不明确、缺乏长期用药获益和安全性证据。随着糖尿病综合防治理念的深入,临床医生已经更加关注糖尿病并发症的综合防控,中成药的综合治疗优势受到关注,总结起来具有如下特点:①缓慢,起效慢,持续服药方可表现出降糖作用,②缓和,中药降糖的作用强度往往比较弱,③综合疗效,中药降糖往往是表现出整体调节和综合症状改善,这与复方多途径、多靶点作用有关,④在改善糖尿病并发症具有优势。

    目前市面上的口服降糖中成药存在共性问题有:基础研究薄弱,临床定位不清晰,表现为说明书的适应症中描述过于宽泛,绝大多品种的说明书中不良反应和注意事项为尚不明确,大部分企业未开展药物不良反应系统监测。针对中成药的作用特点和存在的共性问题,提示我们在降糖中成药的新药开发和二次开业中应该重视和关注如下三方面:

    1.突出品种特色和优势  从中药的特点和特色出发,借助适当的动物模型进行有针对性的研究,挖掘产品的特色和优势,为未来的可能临床定位提供科学依据,为产品的临床价值体现打下坚实基础。

    2.针对并发症开发药物  糖尿病慢性并发症发病机制尚未完全明了,目前临床主张采用强化降糖的同时进行综合干预。开发针对糖尿病并发症中成药技术层面可行,临床需求未被满足。开也是中成药的差异化竞争出路之一。

    3.已上市药物的二次开发  从已上市的用于糖尿病的中药看,中成药对于糖尿病症状或中医证候的改善及对糖尿病并发症的治疗方面往往独具优势。如果定位为联合化药应用解决化药不能干预的临床症状的话,可能就需要更多的通过临床来证实和体现,临床前研究阶段就不宜以单纯降糖指标为主要终点,同时考虑各种并发症的可能干预及作用途径的探讨。对于干预糖耐量的低减也是中药降糖药的一个主要领域,也符合中医治未病的理念。

    三、结语

    糖尿病对人体健康的最大危害在于其并发症,糖尿病并发症分为微血管(小血管受损)并发症和大血管(大血管受损)并发症。糖尿病的防治策略要从单纯的降糖发展到解决胰岛素抵抗,全面防治糖尿病并发症。糖尿病并发症的防治需要在长期强化血糖控制的同时进行多种危险因素的综合干预。

    多数的中成药复方降糖药物发挥作用往往是对机体整体调节和综合症状的改善,其降糖作用主要途径是通过改善胰岛素抵抗,增强组织对胰岛素的敏感性,降糖中成药可能的优势在于能通过整体调节和综合干预达到降低或减少并发症的发生。合理选用上述动物模型对于评价降糖作用特点,在相应的药效学研究中进行降糖及干预并发症作用机制的探索,以期阐述中药综合干预糖尿病的科学内涵,使得在未来的糖尿病综合防治中,中药复方有可为之处。
     

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