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  • 铁皮石斛带节茎段的组培快繁体系研究

  • 来源:中国民族医药杂志 作者:马玉申 刘 钦 刘小倩 欧立军 时间:2013-10-31 09:27:00
  • 核心提示: 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo),为兰科石斛属多年附生草本植物,我国传统珍贵药材,《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》和《现代中药大辞典》等均有记载,新鲜或干燥茎入药,具有益胃生津、滋阴清热、

      铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo),为兰科石斛属多年附生草本植物,我国传统珍贵药材,《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》和《现代中药大辞典》等均有记载,新鲜或干燥茎入药,具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺之功效。现代药理研究表明,铁皮石斛不仅含有人体所需的多种氨基酸和丰富的微量元素,还含有石斛多糖和石斛碱等药用成分,具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力。等功能,对心血管、消化系统、呼吸系统和眼科疾病均有明显的治疗作用。野生铁皮石斛不仅生长缓慢且自身繁殖能力很低,种子在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,对生境要求苛刻;而一般分株、扦插方法的繁殖率也极低;再加上人为的过度采挖和破坏其生境,野生铁皮石斛早已濒临灭绝,难于满足市场生产的需要。上世纪80年代,国家已将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种,国家第一批《中国珍稀濒危保护植物名录》也将其列入其中。
        规模化人工栽培是更好地保护铁皮石斛野生资源和保障其资源可持续利用的主要手段,而组织培养是实现人工栽培的重要前提。关于铁皮石斛组织培养的报道较多,归纳起来,当前铁皮石斛的组织快繁主要有3种途径:铁皮石斛种子的无菌萌发、外植体诱导原球茎再增殖分化得到试管苗和器官外植体诱导愈伤组织或芽分化,但用前2种快繁途径存在些问题。如用种子做外植体,种子的收集受季节限制且消毒灭菌程度和基本培养基难以掌握;而原球茎的诱导在启动阶段较困难,而且对培养基营养成分要求也颇多,大部分需要椰子汁、苹果汁、土豆汁。等作为附加物添加到培养基中,不仅提高了实验成本,而且容易感染细菌,加大了实验难度,不太适合试验条件一般的实验室进行推广研究。第3种快繁途径中用于外植体的根兜、茎尖、带芽茎段、不带芽幼嫩茎段等多种选择,这种方式的外植体取材较浪费,而不见直接采用带节茎段进行丛生芽诱导的研究报道。本研究采用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体,不添加有机添加物的前提下,用不同基本培养基、植物激素组合等处理,探索促进铁皮石斛茎段丛生芽诱导、增殖及生根的有效方法,为铁皮石斛的快速繁殖提供新的理论依据。
    l材料与方法
    1.1材料:供试铁皮石斛,由湖南新宁林科所提供,以带节的茎段作为外植体(图l—a)。
    1.2方法
    1.2.1  预处理与消毒方法:将采集的茎段先用洗洁精清洗后,剥去节上叶片和膜质叶鞘,置自来流水下冲洗30~40分钟,将嫩枝剪成约1.5era长带茎节的小段。采用常规消毒法,75%酒精浸泡35s,0.1%升汞溶液浸泡lOmin,无菌水漂洗4—5次,最后用无菌滤纸吸干水分。
    1.2.2培养条件:所有培养基蔗糖浓度均为2%,琼脂粉浓度均为O.8%,pI-15.6~5.8,并在121℃、131kPa的条件下灭菌15min。将接种的培养基置于培养温度(26±1)℃,光照强度为15001x,光照12h/d的RXZ型人工气候箱中培养。
    1.2.3基本培养基的筛选:为了得到最适宜的基本培养基,进行不同浓度的MS培养基对外植体腋芽诱导影响的对比试验。在附加物(6~BA2.0mg/L和NAA0.5mg/L)相同的条件下,采用MS、1/2MS、1/3MS和1/4MS4种培养基,各培养基处理接种8瓶,每瓶接种5个外植体,每个处理3次重复。培养25d继代1次,培养75d后统计腋芽个数,并观察、评估腋芽粗壮度和叶色,筛选出最佳基本培养基。
    1.2.4腋芽的诱导:将切段外植体接种到附加不同浓度6一BA和NAA的12种不同处理的最佳基本培养基上:,进行腋芽的诱导培养。每个处理接种外植体8瓶,每瓶接种4段,每个处理3次重复。培养25d后继代,以25d为1周期,每个周期观察3次,培养75d后统计腋芽数及腋芽生长状况,筛选出生长素与细胞分裂素最佳配比。
    1.2.5丛生芽的增殖:将诱导培养75d后茎节处长出的新芽切下,接种到附加不同浓度6一BA和NAA的5种不同处理的最佳基本培养基上,进行丛生芽簇的增殖培养。每个处理接种新芽8瓶,每瓶接种3个新芽,每个处理3次重复。培养30d后继代,以30d为一周期,每个周期观察5次,培养90d后统计计算增殖率和丛生芽的生长状况,筛选出生长素与细胞分裂素最佳配比。
    1.2.6组培苗的生根培养:把上述经增殖培养后得到的生长旺盛、高3cm左右的组培苗进行切割,并接种到经筛选得到的附加浓度比例不同的IBA和NAA的6种不同处理的最佳基本培养基上(均加有0.2%的活性炭),进行组培苗的生根培养。每个处理接种组培苗16瓶,每瓶接种3棵组培苗,每个处理3次重复。培养40d后继代,120d后统计不同培养基里组培苗的生根率(生根率=有生根现象的组培苗/原接种的组培苗)及平均生根系数(平均生根系数=生根条数/有生根现象的组培苗),并记录组培苗的的长势。
    1.2.7组培苗的移栽驯化:当生根培养基中的组培苗长在3cm以上,带有4—5片叶,有4—5条2cm以上的根时,开始移栽驯化。将清洗过的组培苗晾干后,移栽到底部均垫有细砖块、上层分别铺着厚约10cm的5种基质(移栽前浇透水)的花盆里,移栽基质分别为细木屑、细沙、树皮、菜园土、炉灰渣(小颗粒状)。
    2结果与分析
    2.1基本培养基的筛选:外植体接种20d后茎节处开始出现膨大,并逐渐长大,长至35d左右,出现黄绿色斑点,并逐浙变为绿色,生长到50—60d后,可在茎节处长出1—2个新芽,到了后期,1/2MS培养基中长出的新芽偶有白色蜷根出现,说明1/2MS培养基在加入合适的生长调节剂后适合根的生成。从接种的4种基本培养基来看,MS基本培养基不适合铁皮石斛芽的诱导萌发,诱导率极低,只有7.5%,且容易产生褐化现象,外植体死亡;1/2MS培养基诱导率最高,达到65.O%,芽的长势最好,芽叶色翠绿、茎径中等(图1_b);随着培养基成分浓度进一步降低,1/3MS和1/4MS培养基中的外植体绝大部分在后期白化死亡(表1)。
    表1  不同基本培养基对铁皮石斛带节茎段丛生芽诱导的影响
     
    2.2激素组合对茎段诱导腋芽的影响:以1/2MS为基本培养基,不同的激素组合对铁皮石斛腋芽的诱导有明显的影响。从接种的12种基础培养基来看,10号培养基的腋芽诱导率最高,达蓟93.3%,诱导的腋芽达到36个,诱导的芽叶色浓绿、粗壮;其次是11号培养基,腋芽的诱导率为80.0%,诱导的腋芽数为31个,诱导的芽叶色绿色、较粗壮;最差的是1、5和9号培养基,绝大多数外植体茎节在初代培养时均无膨大现象,并在后期逐渐褐化死去,只有极少数有萌发现象,但是长势较弱,不适合进行下一步的转接,推测带节茎段需要在细胞分裂素6一BA与生长素NAA的共同作用下才能萌发出较理想的腋芽。在合适浓度的NAA存在下,随6一BA浓度的增加,腋芽的诱导率有一定幅度的增长趋势,芽的健壮度也有小幅增长。在相同浓度的6一BA条件下,随着NAA浓度的进一步增加,诱导的芽较细长,后期较容易萎蔫。6一BA在2.0mg•L。时,NAA在O.2-0.6m∥L范围内诱导效果均较好,其中NAA浓度在0.2mg/L时效果最好。因此,铁皮石斛腋芽诱导的最适培养基为1/2MS+2.Omg•L“6一BA+0.2mg•L。NAA(表2,图1一c)。
        表2不同植物生长调节剂对带节茎段诱导腋芽的影响
     
    2.3激素组合对丛生芽增殖的影响:经过观察发现,将腋芽切下接种到设计的培养基中,培养至40d左右,可在芽的切口处长出2~4个丛生芽簇,将丛生芽簇切割后,再在培养基中继续增殖培养,可获得大量的丛生芽。结果表明,6一BA与NAA的激素组合不仅可以促进丛生芽的增殖分化:同时也有利于芽的生长,叶色浓绿,茎粗壮。当6一BA的浓度为1.5mg•L~,NAA的浓度为0.5mg•L。时,铁皮石斛丛生芽的平均增殖系数(平均增殖系数=丛生芽数/有增殖现象的丛生芽)最高,达到5.46,增殖的的丛生芽数量最多,长势最好(表3,图1一d)。所以,铁皮石斛丛生芽的增殖最适培养基为1/2MS+1.5mg•L一6一BA+0.5mg•L—NAA。
      表3不同植物生长调节剂对铁皮石斛丛生芽增殖的影响
     
    2.4激素组合对幼苗根诱导的影响:将组培苗接种于不同生长素配比的生根培养基中(均加有0.2%的活性炭),40d后可以观察到少数几瓶有短小的白色蜷根形成,到60d时.根长有1—1.5cm,根皮色白中带绿,100d后左右各个处理的组培苗生根率基本不变。当NAA与IBA的浓度均为0.5mg•L“时,铁皮石斛组培苗的生根率最高,达到72%,此时株高、根长及健壮度都最好(表4,图1一e)。因此,铁皮石斛组培苗根诱导的最适培养基为1/2MS+0.5mg•L。NAA+0.5mg•L“IBA+O.2%活性炭。
        表4生长素对组培苗苗生根的影响
     
    2.5组培苗的出瓶移栽:组培苗移栽后lOd可见是否成活,移栽成活后,20d左右开始正常生长,40d时能观察到新芽的萌发。统计发现,以细木屑为移栽基质组培苗成活率最高,可达88%,这可能与铁皮石斛是气生根,有明显的好气性和浅根性,而细木屑具有疏松透气、排水良好、不易发霉等相关。
     
        目前,用于铁皮石斛组培快繁的外植体主要集中于幼嫩茎段、种子等,且多诱导原球茎发生,再进行增殖分化与生根成苗。本文采用带节茎段作为外植体的研究表明,在合适的培养条件下,铁皮石斛无菌茎段可以高效萌发,具有取材易、繁殖系数高、变异率低等优势。在切取茎段时,保证每个茎段中带有茎节,培养1~2个月在茎节处可产生腋芽,说明茎节的芽点具有较强的分生能力。
        植物激素是培养基中的关键物质,用量虽小,但激素的种类与浓度在铁皮石斛组织培养中起着重要作用。生长素的功能是促进细胞伸长,调节愈伤组织的形态建成,诱导根的分化;细胞分裂素的生理作用是促进细胞分裂与扩大,诱导芽的形成,解除顶端优势,促进侧芽萌发生长,降低根的生长速度。通常使用的激素包括6一BA、NAA、IAA、IBA等,而NAA和6一BA组合常用于诱导分化培养,IBA常用于生根培养。本文研究发现,较高浓度的6一BA与低浓度的NAA有利于铁皮石斛芽的诱导分化,这与朱艳等的研究结果一致。单一的细胞分裂素6一BA对芽的诱导不及附加适当浓度NAA的协同作用。6一BA浓度过高或过低都不利于丛生芽的增殖,可能的原因是浓度太低不能满足丛生芽增殖时细胞分裂的激素需求,浓度太高又过度扰乱植物体内的激素水平,造成细胞变异,故接种的芽会出现颜色变黄,甚至死亡的现象。本文结果同时表明,生长素组合有利于根的形成,在NAA浓度不高于0.5mg•L。的条件下,其促进生根的能力与浓度呈正相关。

     

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